野生牛肝菌内生真菌分离鉴定及其生物学特性（一）

发布时间：2021-11-09 22:53 编辑者：特邀作者周世红

内生真菌定殖于健康的生物组织内部，是构成菌物生态系统的天然组分，目前，具有抑菌、抗癌等活性的大量次级代谢产物从内生真菌中分离出来，且研究表明，在内生真菌与宿主保持着互惠共生关系的长久进化过程中，其具有与宿主相同或相近的代谢途径，从而产生与宿主相同或相近的次级代谢产物，故内生真菌可成为潜在的替代药源，也将成为开发生物活性物质的资源宝库，并且内生真菌之间通过相互作用共同促进宿主的生长发育，也可与大型真菌的协同作用促进宿主产生更多的代谢产物。

牛肝菌是真菌界，担子菌亚门，层菌纲，伞菌目的大型真菌，我国已知牛肝菌科有28属，397种及变种，主要产地在云南。其子实体含有大量人体必需氨基酸、矿物质、以及多种生物活性成分，具有降血脂、抗氧化、护肝、抗肿瘤、降血糖、清热解烦等功能。牛肝菌是一个复杂的生命体，其整个生命周期都伴随着内生真菌，据报道，大部分牛肝菌是优良的外生菌根真菌，其生长对寄主要求严格，绝大多数种类仍不能通过人工栽培形成子实体。目前，对于牛肝菌的研究主要集中在化学成分、生物活性等方面，而对于牛肝菌内生真菌的报道较少，丁小维等采用组织分离法从牛肝菌子实体中分离出2株内生真菌，通过ITS分子鉴定分别为毛霉属和黄瘤孢菌，2株内生真菌的发酵液均对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌表现出了较强的抑菌活性。岳万松等采用组织分离法从4种牛肝菌子实体中分离出5株内生真菌，经ITS分子鉴定分别为毛栓菌、假丝酵母属、被孢霉属、散囊菌属、金色毛壳菌，经过rDNAITS二级结构辅助分析后，得出牛肝菌内生真菌具有多样性特征的结论。

在野生牛肝菌子实体获得母种菌丝的分离过程中，明确与其内生真菌的关系，是获得原种、栽培种的基础，也是获得新的真菌资源途径之一，故探究野生牛肝菌内生真菌的生长规律及内生真菌之间的拮抗关系，可为深入研究野生牛肝菌与内生真菌之间的关系进行初步探究。组织分离法是分离内生真菌的重要方法之一，本研究通过组织分离法从3种新鲜野生牛肝菌中分离获得4株内生真菌，结合菌株的形态特征和rDNAITS序列分析，对菌株进行鉴定，构建出系统发育树，并对几种内生真菌生物学特性进行研究，可为牛肝菌生长过程及采摘后的生物防腐提供优良的生防菌株，同时为开发新资源化合物提供菌种资源，对牛肝菌的开发利用及人工栽培等具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜野生牛肝菌子实体：黄皮疣柄牛肝菌、小美牛肝菌、双色牛肝菌分别采摘于云南省楚雄彝族自治区禄丰县和南华县，无菌袋、冰袋封装，空运24h内分离；GK2043（胶回收试剂盒）、GK1071（DNA提取试剂盒）、引物ITS1和ITS4　上海捷瑞生物工程有限公司合成；固体培养基CPDA：马铃薯200g，葡萄糖20g，KH₂PO₄3g，MgSO₄·7H₂O1.5g，VB11mg，蛋白胨0.5g，琼脂20g，水1L，pH自然（液态培养基去掉琼脂）、固体培养基Pachlewski：葡萄糖20g，酒石酸铵0.5g，KH₂PO₄1g，MgSO₄·7H₂O0.5g，VB₁0.1mg，琼脂20g，1mL/L微量元素混合液（H₃BO₃8.45mg，MnSO₄5mg，FeSO₄6mg，CuSO₄0.625mg，ZnCl₂2.77mg，（NH₄）₂MoO₄0.27mg），去离子水1L、固体培养基MMN：NaCl0.025g，葡萄糖10g，KH₂PO₄0.5g，麦芽浸粉3.0g，VB10.1mg，CaC1₂0.05g，（NH₄）₂HPO₄0.25g，琼脂20g，FeC1₃0.012g，MgSO₄·7H₂O0.15g；75%乙醇　实验室自制；JY300C电泳仪、JY02G凝胶成像系统，北京君意电泳设备有限公司；Beckman-JT-25R高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；ABI3730测序仪，北京东迅天地医疗仪器有限公司。

JY300C电泳仪、JY02G凝胶成像系统，北京君意电泳设备有限公司；Beckman-JT-25R高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；ABI3730测序仪，北京东迅天地医疗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 野生牛肝菌内生真菌分离与纯化

将新鲜野生牛肝菌子实体用自来水冲洗数次，去除表面杂质，无菌水冲洗4遍，75%乙醇漂洗2min，再用无菌水冲洗5次，无菌纱布擦干子实体表面。采用组织分离法进行以下操作，用无菌解剖刀将牛肝菌子实体纵切开后，将内部的组织切割成0.5cm2左右的小块，接种于CPDA培养基中，25℃恒温避光培养5d。待小块组织周围有内生真菌菌丝长出后，挑取少许菌丝，采用点植法纯化培养，转接4次。共获得23株纯菌株，并移接至斜面试管4℃保存。

1.2.2 野生牛肝菌内生真菌形态学鉴定

将23株真菌分别点植固体平板培养，挑选出形态、颜色有明显差异的菌落4株，分别接种到CPDA固体平板上，25℃避光培养5d，观察菌落形态，显微镜观察菌丝及分生孢子颜色、形态，以十字交叉法记录菌落直径，且移接至斜面试管，待培养长出菌丝体后，4℃保存。1.2.3基于rDNAITS序列分析的内生真菌分子鉴定　采用GK1071提取试剂盒，对4株纯化菌株进行DNA提取。使用真菌ITS鉴定通用引物：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’对DNA的ITS片段进行PCR扩增。扩增体系为30μL反应体系，包括：10×TaqBuffer3μL，dNTP1μL，Taq酶1μL，上游引物（10μM）和下游引物（10μM）各1μL，DNA模板2μL，ddH₂O补足至30μL。反应条件：预变性95℃，5min，95℃，15s，95℃，15s，95℃，45s，35个循环，72℃，5min保存。PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳体系检测，采用凝胶成像系统观察结果。

PCR扩增产物用胶回收试剂盒GK2043回收，送到上海捷瑞生物工程有限公司进行测序。将4株内生真菌所测序列在GenBank中进行BLAST对比，选择同源性高于95%的序列，运用MEGA-X软件进行多重比较，通过NJ法构建系统发育树，并以bootstrap对发育树进行自举法检验1000次，从而确定菌株的亲缘关系及分类地位。

1.2.4 液态发酵及干基生物量的测定

接种1cm²菌丝块于装液量为80mL的250mL三角瓶中，在25℃，摇床转速160r/min培养，分别称量2、4、6、8、10d的生物量干重，每组设置3个重复，将发酵液在5000r/min离心10min，收集菌丝体移至干燥皿中，置于70℃烘箱中，每隔1h取出称量，直到重量不再改变，即为生物量干重。

1.2.5 野生牛肝菌内生真菌的拮抗实验

为探究牛肝菌自身内生真菌之间的拮抗作用，参照刘青等方法利用平板对峙法进行拮抗实验，将纯种菌种接种到新的CPDA培养基上，接种后的平板置于25℃条件下避光培养，培养至5d，期间观察菌落形态，十字交叉法测量菌落生长直径，以第5d时菌落直径计算抑菌率。对照组设置为单独接种腐败菌（BBFO10尖孢镰刀菌为腐败菌），每组对峙设置3组重复，抑菌率（%）=（对照组病原菌的菌落直径-对峙组病原菌的菌落直径）/对照组病原菌的菌落直径。