食品污染溯源技术的研究及应用（二）

四、食品中微生物分子分型溯源技术

有统计显示，在影响中国食品安全的诸因素中，微生物污染仍高居首位。根据原卫生部通报，中国1990年一1999年10年间发生的食物中毒事件中，微生物食物中毒居各类食物中毒病原的首位，是威胁中国食品安全的头号杀手。2007年报告的食物中毒事件中，微生物性食物中毒的人数占中毒总人数的58.86%。食品的微生物污染是由一些致病微生物引起的，主要包括细菌、真菌和病毒三类。由于微生物具有较强的生态适应性，食品原料在种植、收获、伺养、捕捞、加工、包装、运输、销售、保存以及食用等每一个环节都可能被微生物污染。

1、食品微生物污染途径及其特征

（1）食品微生物污染途径

食品原料通过运输、忙存、加工直至制成成品以及销售等一系列过程，都有可能遭受微生物污染。在食品原料阶段，受到自然环境的污染，称为原发性污染或一次性污染；如粮食、果蔬在收获前的污染或畜禽在宰杀前的感染；在加工、运输、贮存过程中遭受污染称为继发性污染或二次性污染。

食品微生物污染，主要来自土壤、水、空气等环境和人畜粪便；微生物也可从尿、汗、唾液、痰中排出而污染食品；皮肤、毛发、手指、爪、昆虫、鼠类上附着的微生物，植物中繁殖的真菌及其毒素也可造成食品污染。

①土壤

土壤在自然界中是微生物数量最大、种类最多的场所，不仅有天然栖居的固有微生物，而且有很多外来微生物。如果土壤使用未经过无害化处理的人畜粪便施肥，或用未经处理的生活污水、医院污水、工业污水进行农田灌溉，土壤中就有可能存在多种病原微生物或寄生虫卵。
粮食、蔬菜与水果等植物性食品是经土壤培育出来的，与土壤密切接触，因此特别容易受到土壤微生物的污染。常见的病原微生物有沙门菌、志贺菌、致病性大肠埃希菌、霍乱弧菌和肠道病毒。土壤中的病毒可吸附在土壤颗粒上，长期存在于土壤中的病毒可在蔬菜生长和成熟过程中进人到植物组织内部。除此之外，土壤中还有大量的芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属及各种霉菌，如根霉、毛霉、链格（交链）孢霉、曲霉、青霉和镰刀菌等，有些菌本身就是植物病原菌。谷物类作物在生长、收割和贮藏过程中经常染有各种霉菌。

②水

水是一种污染源，因为淡水中本来就存在着一些固有的微生物类群，包括常见的假单胞菌属、五色杆菌属、黄杆菌属、产碱杆菌属等。水和土壤两者常在同一环境中难以分开，常常由于雨水的冲刷，将土壤中的微生物迁移到水中，所以水中也常存在一些土壤中的微生物甚至是病原微生物。生活污水、生产废水不合理排放，使淡水水源遭受污染，可直接或间接污染食品。

在海湾及近海岸处，因有内陆江、河水的流入，有机物质含量高，微生物数量也多，对海产品的污染较为严重。养殖水域如果卫生条件达不到标准，也将对养殖的鱼、贝类造成污染。常见的病原微生物有肠道致病菌、副溶血性弧菌及肠道病毒等。

水不仅是重要的污染源，而且是微生物污染食品的重要途径。在很多情况下，食品被微生物污染，是通过水作为媒介的。如生产食品的用水不合卫生标准，将造成大批食品的污染。

③空气

空气是不适于微生物生长繁殖的环境，能在空气中存在的微生物多是一些耐干燥和耐紫外线能力较强的革兰阳性球菌、革兰阳性芽孢杆菌及霉菌孢子等。当然，在空气中有时也会出现一些病原微生物，如结核杆菌、金黄色葡萄球菌等，通过污染食品而引起感染。食品在采集、贮存与加工过程中不可避免地要与周围环境的空气接触，而空气的流动性又很大，很容易将带有微生物的土壤、尘埃及飞沫播散到食品上，造成食品的污染，所以生产食品车间空气微生物的污染程度，会直接影响到食品的卫生质量。

④人与动植物

人与动植物体表面、人与动物的消化道和上呼吸道均有一定种类的微生物丛存在。若食品被其污染，常导致腐败变质。当人畜患病时，就会有大量病原微生物随着粪便和分泌物排出体外，如果排泄物处理不当，则可能会直接或间接污染食品。寄生于植物体的病原微生物，虽然对人和动物无感染性，但有些植物病原菌的代谢产物却具有毒性，污染食品后，可对人体造成危害，如禾谷镰刀菌。

人的双手是将微生物传播于食品的媒介，特别是食品从业人员，直接接触食品，污染食品的机会是相当多的。

仓库和厨房中的鼠类、蟑螂和苍蝇等小动物和昆虫常携带大量微生物，鼠类常是沙门菌的带菌者。

⑤生产环境与食品用具

生产环境的卫生状况不良，生产设备连续使用，不经常清洗、消毒，常常会有微生滞留和孳生，造成食品的污染。一切食品用具，如食品原料的包装物品运输工具、生产加工设备和成晶的包装材料或容器等，都有可能作为媒介散播微生物，污染食品。食品离任过程中，因生熟不分可造成交叉污染。

2、食品微生物污染特征

从上述分析可知，食品微生物污染来源广、易污染，同时污染程度成微生物的数量与食品生产加工的环境如温度、湿度、营养等密切相关。如在种植后期污染的微生物，由于经过收获时的高温烘干，微生物可能处于休眠期或者只有孢子，但可能在后期室温条件下才萌发。

1、数量变化

食源性病原体在食品中数量的变化.依据食品的种类和加工处理方法不同而异。一般日常食品的活菌数为10⁴/g～ 10⁷/g，例如活鱼的肉组织是无菌的，但在表皮上的活菌数为10³/cm²～ 10⁸ /cm² ，鰓、肠道附着的活菌数为10³/g～10⁶/g。鱼死后，这些菌就会侵入肉组织内。冷冻鱼、贝类也存在10² /g～ 10⁵/g的菌量.就是在刚刚煮熟不久的米饭中，也附着有10²/g～10⁶/g残存的细菌耐热性芽孢。

2、构成的变化

污染食品的微生物以相互括抗、竞个或共生状态等形成微生物丛，其构成随时间面变化，由很复杂的微生物丛变为单纯的微生物丛。当食品的AW高、含糖丰富时细菌繁殖占优势；干燥食品和水果、蔬菜等，靠菌生长良好。通气性的食品和表面积大的食品，需氧微生物多反之，通气不良，肝大的食品内部，常见厌氧微生物繁殖。通过基质的分解、代谢产物的积蓄及随之pH发生变化等微生物丛的构成也会发生变动。

四、微生物分子分型溯源的原理

微生物分子分型溯源的基本方法是微生物菌群分析方法，是基于外界环境影响食品中微生物菌群平衡的原理而建立的。不同环境中微生物的数量尤其是细菌的种类和特性差异很大，它们均可用于区分食品的原产地。

检测细菌种类和特性常用的技术分为传统生物化学技术和分子生物学技术两大类。传统生物化学技术包括API种类分析、抗生素抗性分析和酶联免疫检测分析。API种类分析方法需要对不同种类的细菌进行分离，操作比较繁琐，费时费力。抗生素抗性分析是近来发展用于区分生物体地城来源的一种方法，如在水产业中大量抗生素的使用致使鱼和水环境中出现细菌的生物多样性，通过分析细菌的抗性和多抗图谱，可作为地城鉴别的指标。酶联免疫检测分析能快速检测样品中的特定细菌种类，如对沙门氏菌、李斯特菌等的检测。

分子生物学技术主要包括变性凝胶梯度电泳和DNA单链构型多态分析。DGGE 和SSCP是基于PCR产物的电泳分析。DGGE 是对双链DNA片段进行的电泳分析。梯度聚丙烯酰胺凝胶从顶端到底部，温度呈线性增加，不同序列的DNA链在其熔点处聚集，形成DNA条带图谱。SSCP 是对单链DNA片段进行的电泳分析。由于分子之间的碱抗配对，DNA单链会形成级结构，不同序列DNA其二级结构不同，在电泳过程中迁移率各不相同，从而形成特定的条带请图。DGGE和SSCP技术可达到变温洗脱高压液相色谱（DHPLC）的检测效果。

除以上技术外，变性高效液相色谓和DNA芯片技术也可应用到微生物菌群鉴定分析中。目前,这两项技术在食品潮源中的研究还未见报道。

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