水环境中致病菌分子生物学检测技术研究进展（三）

2． 3 生物传感器

目前，致病菌检测不仅对灵敏度、特异性、检测限、检测时间、操作复杂程度和人员培训等关键问题具有较高要求，对经济高效的现场监测设备的需求也越来越高，因此生物传感器逐渐应用于致病菌的快速检测。生物传感器是一种将生物物质浓度转换为电信号进行检测的仪器，有多种分类方式:

( 1) 根据分子识别元件可分为酶传感器、微生物传感器、细胞传感器、组织传感器和免疫传感器;

( 2) 根据信号转换器可分为生物电极传感器、半导体生物传感器、光生物传感器、热生物传感器、压电晶体生物传感器和声学生物传感器;

( 3)根据输出电信号的测量方式可分为电位型生物传感器、电流型生物传感器和伏安型生物传感器;

( 4) 根据被测目标与分子识别元件的相互作用方式可分为生物亲和型生物传感器、代谢型或催化型生物传感器。

在检测复杂水质时，识别元件与待测微生物的不可逆性化学反应会降低识别元件的识别能力，影响传感器的灵敏度。适配体的引入及其在传感技术中的广泛应用可有效增强致病菌检测的敏感性。核酸适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合。开发了一种基于纳米粒子与适配体结合的生物传感器来检测大肠杆菌 ATCC 8739，该检测器的检测范围为
5 ～ 1 × 10⁶ CFU/mL，检测限为 3 CFU/mL，检测时间 ＜ 20 min。开发了基于微流体的全自动电化学生物传感器并对磷酸盐缓冲液( PBS) 中的大肠杆菌进行定量检测，发现其检出限低至 50 CFU/mL 且特异性高。此外，其分析地表水样时的检测限与模拟实验相同，但传感器信号略有下降。生物传感器在致病菌收集和检测之间几乎没有时间延迟，但在检测过程中存在细菌细胞导致薄膜阻抗增加、革兰氏阴性菌检测限高和光流控传感器灵敏度低等问题。

2． 4 DNA 微阵列技术

微流体技术出现于 20 世纪 80 年代，该技术精确地控制流体的性能，并将流体限制在一个很小的几何尺度( 通常为亚毫米) 内，进而产生了芯片实验室或 DNA 微阵列技术。DNA 微阵列技术又称 DNA 阵列或 DNA 芯片，一般用于检测不同生长条件下细胞基因的表达、DNA 序列的特异性突变或者表征环境样品中微生物的特征。DNA 微阵列含有高密度固定化核酸( 基因组 DNA、cDNA或寡核苷酸) 的有序二维矩阵，能够通过核酸杂交同时检测单个样品中的数百个基因，也可以同时快速检测多个生物体的多个基因。该方法能够筛选大量序列，具有很强的自动化能力，并且具有检测时间短、操作简单和检测设备简单易于携带的优势。开发了一种能检测 12 种食源致病菌的芯片，其特异性良好且检测限低至1 CFU/mL。设计了基于实时PCＲ 的微阵列芯片，该芯片能够同时检测 4 种水生致病菌( 铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌) 。但是，目前该方法成本相对较高，不能区分待检样品中的活、死菌且样品
量消耗非常大。此外，还可能产生非特异性杂交，导致特异性和敏感性降低。而 DNA 微阵列与靶基因 PCＲ 扩增相结合能够提高致病菌检测的灵敏度，即将 PCＲ 扩增目标基因产物杂交到一个低密度的 DNA 芯片上进行检测，信号灵敏度能够增加约 1 × 106倍。

2． 5 高通量测序技术

近几年，高通量测序技术( High － throughput sequencing，HTS) 的开发与应用促进了宏基因组学的发展。HTS 可以读取数 10 亿的环境样品 DNA序列( reads) ，分析微生物群落组成及功能［11］。目 前，第二代测序技术是最主流的测序技术，测序平台主要有 Ion Torrent( ABI 公司) 、Miseq 和 Hiseq (Illumina 公司) ［118］、454 ( Ｒoche 公司)。高通量测序流程一般分为检测实验过程( 包括样品处理、文库构建、文库质控和上机测序) 和生物信息学的数据分析流程( 包括数据质控、序列比对、注释和变异识别)，其中文库质控是提高测序准确率的关键。此外，HTS 存在一定的系统误差，可通过增加测序深度进行校正，另一方面，测序深度在一定程度上与基因组覆盖度正相关，即测序深度增加，基因组覆盖度也会提高。

目前，HTS 主要利用特异性标记基因、毒力因子和 16S rＲNA 基因鉴定致病菌。

( 1) 特异性标记基 因: 使用特异性标记基因的代表工具是MetaPhlAn2，数据库含有 17 000 多个参考基因组( 包括 13 500 个细菌和古菌、3 500 个病毒和 110种真核生物) 和多达 100 万类群特异的标记因，可以实现快速、精准的分析。目前，运用此方法分析环境致病菌的研究很多。开发了适用于溪流水样的 mPCＲ-HTS 方法，该方法利用 HTS 的高测序深度显著提高了 mPCＲ 的多重水平。通过 HTS 技术分析了供水系统中细菌物种的多样性，发现变形杆菌( 40% ～ 97% ) 是优势菌且检测到梭状芽孢杆菌属和肠杆菌科致病菌。

( 2) 毒力因子: 基于毒力因子的鉴别方法广泛应用于致病菌鉴别，应用较多的是利用细菌毒力因子数据库( VFDB) 中毒力因子确定致病菌，但是 VFDB 数据库中致病菌种类较少，且大多数毒力因子在致病菌中不作为特异性基因存在。

( 3) 16S rＲNA 基因: 目前基于 16S rＲNA 基因鉴定致病菌的应用最广泛，16S rＲNA 是细菌上编码 rＲNA 相对应的 DNA 序列，包含约 50 个功能域，存在于所有原核微生物的基因组中，具有高度的保守性和特异性。将细菌 16S rＲNA 序列测序结果与不断更新完善的数据库比对可以获得致病菌在属和种水平的分类信息，从而快速准确地判断致病菌的归趋。但该方法过度依赖引物的质量，导致 PCＲ 过程中存在固有的扩增偏差。此外，由于同一属内的 16S rＲNA 基因拷贝数不尽相同，定量结果和实际数量会有差异。由于序列长度原因，尽管使用很严格的筛选条件， HTS 也可能存在序列比对上的错误。总体说，采用基于第二代高通量测序的宏基因组学方法检测致病菌存在精度和准度不高的问题，但是其数据通量高。

声明：本文所用图片、文字来源《环境监控与预警》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

相关链接：生物，仪器，苷酸