水产养殖中好氧反硝化细菌的筛选及评价研究进展（二）

3．1 安全性评估

众所周知，水产养殖中应用的微生物菌种必须 是 安 全 的，对鱼虾不能有致病性。然 而，从 92 种动物用益生菌产品中分离出 123 个益生菌菌株，其中 45 个菌株对抗生素耐药，33．7%的益生菌产品被肺炎克雷伯菌等危及生命的病原体污染，而且还发现了炭疽毒素阳性的蜡样芽孢杆菌( Bacillus cereus) 菌株，这对水产动物及人类的健康构成巨大威胁。可见，筛选用于水产养殖的益生 菌 菌 种，进行安全性评估为最重要一环。好氧反硝化候选菌种不能含有任何质粒编码的耐药基因或基因簇，不产生溶血圈，不含有致病基因，不生成毒性代谢产物，且需要结合体内的急性、慢性毒性试验进行验证。

 3．2 菌种鉴定

好氧反硝化菌种鉴定方法同常规微生物菌种鉴定方法类似，包括常规形态学观察、生理生化分析、16S rＲNA 测序和全基因测序等。经过菌种鉴定，可获知菌株的种、属等信息，这对进一步研究菌种的性能及实际应用提供了重要参考。具体而言，以饲料添加剂形式饲喂的菌种需符合各个国家规定 的 菌 种 目录，如美国食品与药物管理局( FDA) 和美国饲料控制官员协会( AAFCO) 公布的可直接饲喂微生物菌种名单( 46 种) 、欧盟准许饲喂的菌种目录( 72 种) 、我国《饲料添加剂品种目录》允许添加的微生物菌种目录( 35 种) ; 而改良水体环境的菌种目前尚未有明确规定，但需要符合之前所提到的安全性要求。 

3．3 耐受性评估

益生菌能够发挥效果的关键因素之一为耐受所应用的环境，并且能够在效应位点定植生长，维持较高 的 活 菌 水 平，而 后 才 能 发 挥 功 效( 图 2) 。不同于陆生动物，益生菌作用水产动物的效应位点除了动物肠道外，还有水环境。因此，筛选的候选好氧反硝化菌株需要耐受所应用的外环境，包括温度、盐度和 pH 等，饲喂的益生菌还需经过胃酸、胆盐等的耐受性评价］。一般而言，能够较好满足这一要求的就是选用池塘或水产动物肠道的土著菌群，在研究美洲红点鲑( Salveli- nus fontinalis) 时发现，同外源益生菌相比，本土的益生菌不会干扰鱼皮肤黏液菌群，是调节鱼类微生物群落更好的选择; 也发现，源于对虾肠道的乳酸杆菌能够更好地适应动物肠道，而且可抑制病原弧菌的生长繁殖; 研究发现，本土菌株越南芽胞杆菌( Bacillus vietnamensis ) VCM5、Bacillus vietnamensis VCM8和支气管戈登菌(Gordoniabronchialis) VCM12 可显著降低对虾养殖废水中亚硝酸盐含量，显示出较好的适应性。此外，某些需要在饲料制作过程中添加的反硝化菌制剂，还需考虑工厂化水产饲料生产的高温、高压耐受性，在这种情况下，应用芽孢孢子可能更为适宜。 

4 菌种的复筛

好氧反硝化细菌的复筛包括: 应用选择性培养基( selective culture medium ) 计算菌种脱氮效率、判断脱氮类型以及借助分子生物学和组学手段研究脱氮机制等步骤。 

4．1 脱氮效率研究

在好氧反硝化细菌脱氮效率的研究中选择性培养基的配方同养殖水体的化学组成存在差异，如表 1 所示，选择性培养基常用氮源为 NH4Cl、 NaNO3 及 NaNO2 等，常用的碳源为琥珀酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖、蔗糖和甘油等。然而，在水产养殖水体中常为有机碳源缺乏，而且氮源变为营养丰富的有机氮源。筛选培养基的富碳特性在实际的养殖环境中很少存在，池塘养殖环境多为低碳高氮，不同于工业污水可以额外提供大量廉价有机碳源，养殖中大量有机碳源的应用可能会造成水产动物缺氧风险及病原微生物滋生等问题出现。基 于 此， 直 接 配 制 0． 05 g /L 的 NaNO2 溶液，并在其中仅补充 1 g /L 粉碎的鱼饲料及粪便以模拟池塘中积累的有机物质，以此反硝化细菌池塘模拟培养基( pond-simulating denitri- fication screening medium，PSDSM) 进行菌种筛选，获得了脱氮效率理想的好氧反硝化菌株 Bacillus subtilis M 7-1，同时，大田应用试验证实，该菌株对养殖池塘中的无机氮也具有较高的降解率。在有机氮( 蛋白胨、尿素) 存在的情况下，研究 反 硝 化 细 菌 海 洋 着 色 菌 ( Marichromatium gracile) YL28 脱氮性能，发现存在有机氮源且添加海藻寡糖后，YL28 对无机氮的去除能力显著增强。可见，在反硝化细菌的筛选过程中，培养基中氮源、碳源的选择及适宜的碳氮比关系着筛得菌株的脱氮性能，研究发现，大多数好氧反硝化细菌的最佳碳氮比在 8 ～ 10，然而，养殖池塘中一般碳氮比在6 ～ 8，因此在筛选培养基配制需考虑这一差异，或在应用中补充缓释碳源以确保菌种的脱氮功能。

温度是反硝化过程的重要参数之一，已有研究显示，好氧反硝化细菌脱氮的适宜温度范围为25 ～ 37 ℃。因此，在菌种筛选的过程中培养温度可设定为 28 ～ 30 ℃ ( 表 1) ，但考虑冷水鱼养殖及春秋季节水体脱氮的需要，嗜 冷 ( 10 ～ 15 ℃ ) 好氧反硝化细菌的筛选也尤为重要。研 究 发 现，好氧反硝化菌台湾假单胞菌( Pseudomonas taiwanensis) 在 15 ℃ 下对硝酸盐的去除率为 100%，具备低温脱氮能力。然而，随着温度的 降 低，菌种的反硝化效率也会随之降低;研究表明，在 10 ℃ 条件下，好氧反硝化菌孟氏假单胞菌( Pseudomonas mandelii) 同硝化和反硝化作用相关的基因表达发生滞后和延迟。由此可见，培养温度的设定需要综合考虑菌种最适条件及所应用的环境这 2 方面因素。

盐度也影响着好氧反硝化细菌的脱氮效率。研究表明，海水养殖的盐浓度( 20‰ ～ 35‰) 已可抑制常见细菌的酶系统并可发生溶菌作用。在反硝化方面，研究表明，在高盐浓度下，反硝化过程的功能基因 nirK 和 nosZ 的表达丰度大大降低，抑制了细菌的反硝化活性。而同时，耐盐好氧反硝化细菌也已有研究报道，从盐芽孢杆菌属( Halobacillus) 、海源菌属( Idiomarina) 、大洋芽胞杆菌属( Oceanobacillus) 和枝芽孢菌属( Virgibacillus) 等种属中分筛到反硝化嗜盐菌;从青岛胶州湾海水沉积物中分离出 1 株反硝化海洋嗜盐菌弧菌; 分离筛选的 Bacillus sp．能够在 16 g /L 的 NaCl 中进行好氧反硝化作用，这些研究对筛选海水养殖中应用的耐盐好氧反硝化细菌提供依据。

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