水产养殖中好氧反硝化细菌的筛选及评价研究进展（三）

4．2 脱氮类型研究

在脱氮类型方面，能够同时进行异养硝化－好氧反硝化的菌株具备更高的脱氮效率，如 Paracoc- cus saliphilus SPUM、Bacillus litoralis N31、Mari- nobacter sp．、Bacillus cereus PB45 及盐田盐单胞菌( Halomonas campisalis) 等( 表 1) 。然 而，不 同 菌种脱氮效率、脱氮类型有较大差异，这或许同反硝化细菌所含酶系的种类和数量不同有关。应用间歇曝气法分筛获得嗜麦芽寡养单胞菌( Stenotrophomonas maltophilia) ，测序发现该菌株未发现亚硝酸还原酶基因 nirK 序 列，只 鉴 定 了nirS 基因序列; 从废水处理的活性污泥中分离筛选的盐单胞菌属细菌( Halomonas sp．) 则鉴定出多种脱氮相关的酶类，可同步发生硝化和反硝化反应，脱氮效率较为理想;对脱氮类型为好氧反硝化的假单胞菌 yy7 进行分析，确定该菌株含有 nirK、norB 和 nosZ 等多个同反硝化相关的因，这些功能基因同菌种的反硝化性能密切相关。 

4．3 脱氮机制研究

筛选的好氧反硝化菌株可通过 PCＲ 及全基因组测序获取脱氮相关的酶系基因，从而进一步分析其脱氮机制。如表 2 所示，反硝化反应在硝酸还原 酶( nitrate reductase) 、亚 硝 酸 还 原 酶( nitrite reductase) 、一 氧 化 氮 还 原 酶 ( nitric oxide reduc- tase) 及一氧化二氮还原酶 ( nitrous oxide reduc- tase) 的催化作用下进行。

由于亚硝酸盐对水产动物的毒害作用较为严重，催化亚硝酸盐转化的酶系非常值得深入研究。研究表明，亚硝酸盐可在由 nir 基因簇编码的亚硝酸盐还原酶、nor 基因簇编码的一氧化氮还原酶及nos 基因簇编码的一氧化二氮还原酶等几种酶的催化下去除。在好氧反硝化细菌中，主要存在 2 种类型的亚硝酸还原酶，一种以 CD1 血红素为辅因子，编码该酶的基因为 nirS; 另一种以铜原子为辅因子，编码该酶的基因为 nirK，自然界中， nirK 基因分布的更广泛，但 nirS 基因更丰富。研究发现，这 2 种周质酶可以发挥相同的功能，但不能在同一种微生物中共存; 然而，在慢生根瘤菌( Bradyrhizobium oligotrophicum) 中发现了编码这 2 种酶的基因。对分离自虾池的好氧反硝化细菌蒙氏假单胞菌 ( Pseudo- monas monteilii) CY06 全基因组测序确定了亚硝酸盐降解相关的 3 类还原酶，包括硝酸盐还原酶、亚硝酸还原酶、一氧化氮还原酶，通过这些酶菌株CY06 能够实现 反 硝 化 过 程( NO－3 →NO－2 →NO → N2O) 的转化，并发现了 5 个亚硝酸还原酶相关的基因( nir1、nir2、nir3、nir4 及 nir5) 。从海水养殖池塘中分离到一株高效脱氮 Bacillus litoralis N31，该菌株存在 hao、napA 和 nirS 基因，具备异养硝化－好氧反硝化能力。对分离自 深 海 沉 积 物 的 菌 株 博 尔 扎 诺 假 单 胞 菌( Pseudomonas bauzanensis) DN13-1 进行基因组分析，找到了同菌株脱氮性能相关的 nirS、norB、 nosZ、nasA 和 amo 基因，证实了菌株存在好氧反硝化途径，其中 nosZ 基因已作为检测假单胞菌反硝化作用的生物标志物。从假黄色单胞菌( Pseudoxanthomonas) 基因组中扩增出 nirS、 nirK、narG 和 narA 基因，该菌株同样具有好氧反硝化脱氮功能。然而，由于反硝化细菌的生物多样性，不同菌株的在降解过程起作用的关键酶和基因不同，且脱氮活性还与环境密切相关，这使得降解机制探索受到很大的限制，尚 需 深 入研究。

5 应用研究

一般而言，体外筛选获得的好氧反硝化菌株还需要通过养殖动物应用试验评估，在实验室模拟水槽或养殖池塘进一步评价菌种的脱氮性能以及对水产动物生长性能、机体免疫和抗病性等方面的影响。应用实验室模拟水槽研究发现，好氧反硝化细菌 Bacillus sp． H2 对亚硝酸盐的平均降解率为 64．04%，总氮和化学需氧量的降解率分别为 16．0%和 32．39%，且提升了水槽中鲤鱼的生长性能和免疫功能。养殖池塘中的研究发现，均匀泼洒 反 硝 化 细 菌 Marichromatium gracile YL28显著降低了零换水对虾养殖池塘中氨氮、亚硝酸盐的积累］，研究也发现，热带念珠菌( Candida tropicalis ) HH8 和 好 氧 反 硝 化 菌 株Pseudomonas stutzeri LZX301 联合应用显示出更高效的脱氮效率，并能在池塘中快速形成生物菌落; 发 现 除 烃 海 杆 菌 ( Marinobacterhydrocarbonoclasticus) 是循环水产养殖系统好氧反硝化脱氮的潜在微生物。同时，还可借助于生物反应器以评估菌种的反硝化脱氮功能，选择好氧反硝化菌株 Z1 和 Z8 进行生物反应器脱氮试验，接种 2 周后达到相对稳定状态，该反应器硝酸盐去除率高于 98． 8%，总氮去除率高于71．8%，脱氮效果理想;研究发现，在好氧条件下，Corynebacterium pollutisoli 可在移动床生物反应器中可进行反硝化去除无机氮素。反硝化细菌饲喂后也能起到较好的脱氮效果，应用具有反硝化功能的贝莱斯芽孢杆菌( Ba- cillus velezensis) AP193 饲喂斑点叉尾 ，显著提高动物生长性能，降低养殖池塘中总磷、总氮及硝酸盐浓度，改 善 水 质 环境，由 此 可 见，在 应 用 试 验中，好氧反硝化菌种也表现出较高的脱氮效率，可改善养殖水体环境。然而，除菌种外，应用试验还受到养殖动物品种、应用剂量、应用方式及试验周期等方面因素的影响。因此，应用养殖动物试验评价好氧反硝化菌种也需考虑上述几方面因素，同时还需结合菌种特点设计评价指标，从而对益生菌菌种功效进行综合评价。 

6 小 结

综上所述，好氧反硝化细菌在养殖池塘的生物脱氮方面具有突出的优势与应用潜力，但不同菌种或相同菌种在不同条件下脱氮效率差别较大，可从样品采集、培养基配制、培养方式及评价方法等方面优选适合好氧反硝化细菌的方法、标 准，进而实现好氧反硝化细菌菌种的快速、高效筛选。未来还需重点研究的内容包括以下几个方面: 

1) 结合养殖水环境特点配制筛选培养基( 碳 源、氮源和碳氮比等) 、设置筛选条件( 溶氧、pH、温度和盐度等) ，筛选适合养殖水环境的好氧反硝化细菌; 

2) 借助宏基因组测序技术，对养殖水体中反硝化脱氮菌群进行全面分析，从而挖掘更高效、耐受性更强的生物脱氮菌株; 

3) 应用多组学技术( 如基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学)从不同层次阐明好氧反硝化机理，比如蛋白质组学可用于研究反硝化酶活性中心的铁、铜等元素功能，通过代谢组学还可分析不同碳源在反硝化过程中关键代谢产物的变化; 

4) 利 用 群 体 感 应
( quorum sensing，QS) 的理论及技术，开展反硝化细菌之间或同其他益生菌的共培养、共发酵( co- culture) 研究。不同微生物共存的菌系能够达到某种协同效应，可进一步提高脱氮效率，而且复合菌系还具有更强的适应性，建议对其深入研究并应用于水产养殖，从而实现更持久、更高效的养殖水体生物脱氮。

声明：本文所用图片、文字来源《动物营养学报》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

相关链接：单胞菌，亚硝酸，菌株