天麻素生物合成的研究进展（二）

3 微生物转化法

3.1 野生菌转化法

相关研究显示，天麻在生长过程中离不开野生微生物地协助，如天麻在种子萌发与无性繁殖 2 个阶段，分别要与紫萁小菇和蜜环菌进行共生才能正常萌发和生长，由此研究者们开始从这些微生物中筛选合成天麻素的相关菌株（表 2），对天麻共生菌蜜环菌进行了筛选工作，并探索了有效的生物转化体系和合适的转化条件，结果显示一株命名为黄绿密环菌 ZJUQH 的菌株被筛选出来，该菌株在底物（4-羟基苯甲醇）质量浓度为 3 mg/mL，转化用细胞用量为6.5 g/30 mL转化液，聚山梨酯-80 1.5%，初始 pH 4.5，转化温度 23 ℃，转化时间 120 h的条件下，天麻素的最大产量可达（5.65±0.45）mg/L。除关注天麻共生菌外，研究者们还不断探索其他合成天麻素的微生物（表 2）。朱宏莉采用静息细胞法和分批培养法，结合薄层色谱法（TLC）和反相高效液相色谱法（RP-HPLC），从 10 株霉菌中筛选出 1 株能将 4-羟基苯甲醛转化成天麻素的根霉 LN-1，该菌在底物浓度为 2.3 mg/mL，转化用细胞用量为 12 g/120 mL 转化液，初始 pH 5.5，转化温度 28 ℃，转化时间 24 h 的条件下，天麻素得率可达 16%。此外，朱宏莉等还利用相同的筛选方法，从霉菌中获得了 1 株合成天麻素的华根霉Rhizopus chinensis SAITOAS3.1165，并对此菌中糖基化4-羟基苯甲醛生成天麻素的糖基转移酶进行了分离纯化。Fan 等]对其他微生物也进行了筛选，获得了臭曲霉 Aspergillus foetidus ZU-G1 和圆弧青霉 Penicillium cyclopium AS 3.4513 2 种利用 4-羟基苯甲醇作为底物合成天麻素的菌株，其中臭曲霉的最高转化产量为 36 mg/L，而圆弧青霉则是 65 mg/L。

以上研究结果说明，除植物外某些微生物也具有合成天麻素的能力，而且相较于植物细胞培养或植株栽培，微生物发酵周期一般较短，所用培养基材料简单，发酵工艺易掌握，因而野生菌转化法比植物转化法更适合天麻素的工业化大生产。

3.2 工程菌转化法

植物转化法和野生菌转化法与人工栽培提取法和化学合成法相比有许多优势，如合成选择性强（位置选择性和立体选择性）、合成条件温和、合成速率快、合成副产物少、环境友好和后期处理简单等，但它们也有不足之处：首先，筛选出能转化前体物质生成天麻素的候选生物较难；其次，候选生物人工培养条件一般较苛刻；最后，作为前体物质的 4-羟基苯甲醇或 4-羟基苯甲醛一方面价格较贵，另一方面它们本身就具有生物活性，在工业上难以大量获得，如果把它们作为工业合成的原料，这既不利于天麻素的规模化生产，同时也会造成最终产品成本的提高，因而当前利用生物合成法生产天麻素还需进一步的改进。

微生物代谢工程是生物合成法中一种既经济又高效的天然产物生产方法，该法以基因工程技术为依托，有目的地对微生物代谢途径进行精确的修饰、改造或扩展、构建新的代谢途径，以改变微生物原有代谢特征，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，达到提高天然产物活性或产量之目的。相比于上面提到的植物转化法和野生菌转化法，微生物代谢工程合成天然产物具有自身的优势。首先，此法用到的微生物（如大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等）都是一些遗传背景了解相对清楚的工业微生物，因而可以比较方便地对它们进行基因工程改造，使它们能合成专一性很高的酶类用于天然产物的生产。其次，微生物代谢工程在合成天然产物时，使用的都是一些价格低廉可重复利用的原材料（如葡萄糖、无机盐等），这就降低了天然产物合成对环境造成的污染和生产成本。最后，构建好的工程微生物可以通过发酵方式得到快速扩增，这一方面缩短了天然产物生成周期，另一方面也有利于大规模工业化生产天然产物。

就天麻素而言，目前已有 Bai 等和钟贝芬等课题组对其展开了微生物代谢工程研究，见表 3 和 图 2。其中 Bai 等将来源于诺卡氏菌的羧酸还原酶（carboxylic acid reductase，CAR）、枯草芽孢杆菌的 Sfp 型磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（Sfp phosphopantetheinyl transferase，Sfp PPTase）和红景天植物的糖基转移酶（uridine diphosphate dependent glycosyltransferase，UGT）73B6 导入大肠杆菌菌体内，从头构建了一条天麻素生物合成的异源途径。在此基础上，他们还通过其他一些技术手段推动菌体内代谢流朝天麻素生成方向流动，如增强分支酸和 UDP-葡萄糖合成的相关代谢通路，利用定向进化方法筛选更适合 4-羟基苯甲醇糖基化的 UGT73B6FS突变体，优化工程菌发酵条件等。经过以上工程化改造，大肠杆菌以葡萄糖为原料，经 48 h 发酵培养后可产生天麻素 545 mg/L。钟贝芬等采用了有别的代谢途径。首先，他们将谷氨酸棒状杆菌中参与 4-甲酚降解相关的基因簇（cresol degradation pathway gene cluster，cre）HIJEFD 和糖基转移酶基因 UGT73B6FS 分别导入载体 pRSFDuet-1和 pACYCDuet-1，并转化大肠杆菌获得重组菌株S1。然后，在 S1 中诱导关键酶的表达，并以 4-甲酚为原料进行生物转化。最后，经合适的发酵条件培养 48 h 后，在菌体内可生成天麻素 1.5 mmol/L（429 mg/L）。以上 2 项微生物代谢工程法合成天麻素的例子都充分证明，向大肠肝菌菌体内引入异源的代谢途径用于天麻素合成是可行的，而且大肠杆菌遗传背景清楚、培养条件简单、发酵周期适中，因而比其他植物或野生微生物用于天麻素合成更为合适，故此法是今后取代传统天麻素获取方法的一个非常有前景的途径。

相关链接：蜜环菌，菌株，天麻素