罗氏沼虾豚鼠气单胞菌的分离鉴定（一）

豚鼠气单胞菌(Aeromonus eaniae)隶属于气单胞 菌科、气单胞菌属,是一种人奋-鱼共患的条件致病 菌，能够引起人类败血症,急性腹泻.胆囊炎.膀胱炎等 疾病"。目前，研究者已经从草鱼、金鱼.南美白对虾、 甲鱼、克氏原鳌虾鲈鱼、中华绒整蟹等多种动物中分 离出该细菌,给水产养殖业带来了巨大的经济损 失的。罗氏沼虾(Macnbrachiwmr rosenbergi0是中国 主要的淡水虾养殖品种之一,因其肉质鲜美.生长遠度 快，养殖周期短等优点而具有较高的经济效益。中国 在1976年从日本引进罗氏沼虾进行养殖,20世纪90 年代,中国罗氏沼虾养殖产业由于对虾遭遇灾难性病 害以及罗氏沼虾育苗技术的突破而获得快速发展,先 在桶建.海南广西等沿海地区迅速发展,随后在江。 浙、沪兴起.并逐渐向北方地区扩展,目前。中国已经 成为罗氏沼虾养殖产业最大的国家,但是随着养殖 密度和规模不断增加，导致罗氏沼虾(M. rosenbergo) 养殖过程中出现了各种各样的疾病,水产养殖业中病 原种类复杂多样，包括衣原体.病毒。细菌.寄生虫 等14。然而，关于虾类病害研究多集中在对虾,而关 于豚鼠气单胞菌引发罗氏沼虾死亡的报道较少,细菌 性疾病可导致罗氏沼虾发病大量死亡,成为威胁罗氏 沼虾养殖业发展不可忽视的因素。

华中农业大学水产学院养殖基地的罗氏沼虾出现 鰓丝肿胀,鰓丝表面出现黑斑, #伴随着食欲下降等症 状。严重时可导致死亡。本研究取濒临死亡的病虾肝 胰腺组织,并进行细菌的分离纯化。将得到的优势菌株 进行回归感染,结果显示该病为细菌性疾病。对分离 菌株的形态.革兰氏染色溶血现象和生理生化等进行 检测#结合I6SrRNA对该分离菌株进行分类鉴定,确 定该分离菌株为豚鼠气单胞菌。对该分离菌株的耐药 性进行了检测,其检测结果为罗氏沼虾细菌性疾病的 有效防治提供科学依据和理论参考。

1材料与方法

1.1 实验材料及仪器设备

哥伦比亚绵羊血培养基、LB培养基细菌生化微 量鉴定管.超净工作台、药敏纸片.PCR扩增仪.电泳 仪.凝胶成像系统.恒温培养箱。

1.2实验动物

病虾采自于华中农业大学水产学院养殖基地,健 康罗氏沼虾亦采自于该养殖基地，在实验室哲养10天 确保稳定无异常后进行人工感染实验。

1·3细茵分离培养

用70%的酒精擦拭病虾体表后放置无菌培养皿

中,使用灭国的接种环取病虾肝胰腺组织，并迅速在 LB培养基上进行划线。30C恒温培养20-24 h,观察细 菌的生长情况,取大小形态相似的优势菌落接种到LB 培养基中反复分离划线纯化培养3-5次,即可得到纯 化的分离菌株.

1.4 细茵形态观察

用无菌棉签刮取纯化的菌株接种于LB培养基 上,30C恒温培养24h观察分离菌株的菌落形态大 小。气味.颜色等,并进行革兰氏染色及显微镜拍照观 察。

1.5 溶血实验

将分高纯化的菌株接种于哥伦比亚绵羊血琼脂培 养基, 30C恒温培养20-24 h,观察分高菌株的溶血现 象。

1.6 细茵生理生化特性鉴定

用灭菌的接种环挑取分离菌株于细菌生化微量鉴 定管，对分离纯化的菌株进行氧化酶、硫化氢.阿拉伯 糖.丙二酸盐、赖氨酸脱发酶.鸟氨酸脱羧酶.枸缘酸 盐、葡萄糖产酸、蛋白胨水.精氨酸水解酶、V-P.明胶、 苯丙氨酸。葡萄糖酸盐进行生理生化特性鉴定,每种生 化反应做3组平行,根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常 见细菌系统鉴定手册ym对分高菌株进行种类进行初 步鉴定.

1.7药敏实验

取100 μ 0.5麦氏单位(1.5x 10* CFU/mL)的菌液 均匀涂布于普通LB固体培养基,用无菌镊子取杭州 微生物试剂有限公司生产的药敏片贴于培养基表面。 正面放置3min后,于30C恒温培养箱中倒置培养24h,. 用游标卡尺测量抻菌圈的直径,每种药物做3组平行， 最后参照杭州微生物试剂有限公司的标准判断每种药 物的敏感性。

1·8分子学鉴定.

(I )细菌DNA模板的制备

使用热裂解法进行细菌DNA提取,具体操作为向15 mL灭菌高心管内加入菌悬液200山,随后将菌液 置于100C水浴锅中煮沸10-12 min,稍冷却后,放入 离心机, 12000 r/min,离心10 min ,取上清液，即为细菌 DNA. .

(2)16S rRNA基因测序和系统发育分析

使用16SrRNA基因通用引物进行基因扩增,引物 序列为16S-27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'.16S- l492R 5 *-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.其产 物大小为1323 tp,引物由武汉擎科生物科技有限公司 进行合成，PCR反应总体系为20 p山,其上下游引物各1山,模板DNA2μL(200ng/LL),灭菌双蒸水6山， TaKaRa premix 10山.反应程序为:94C预变性7 min, .95C 30s.56'C 30s.72'C 90 s,35个循环，随后72C延 伸8min.4C保温.将得到的PCR产物使用2%琼脂 糖凝胶电泳进行目的条带的检测,将检测正确的PCR 产物利用胶回收纯化试剂盒进行纯化,并将纯化后的 产物连接到PMD18-T载体上进行克隆后送武汉擎科 生物科技有限公司进行测序，测序结果通过NCBI Bast进行比对,并使用Mega 6.0软件进行系统发育树 构建。

1·9人工感染实验

将分离菌株接种于普通LB液体培养基，30C震 荡恒温培养14-18h,将菌液配置成10-10CFU/mL2个浓度梯度菌悬液，使用注射法进行人工感染实验， 实验共分为3组,每组10尾虾,每组独立重复2次。实 验组从罗氏沼虾第3腹节肌肉处注射菌液60μL,对照 组注射等体积的0.65%的灭菌生理盐水。在整个实验 期间,每天早晚定时投喂2次,并连续曝气充氧,水温 保持在24C ,每天早晚吸污2次保持水质清新每天定 时观察罗氏沼虾健康状况井及时更换新水,对濒死的 罗氏沼虾按照1.3进行细菌分高纯化后再次进行生理 生化实验以及分子学鉴定等,整个实验观察期为2周。

2结果与分析

2.1病原茵形态特征

从濒死的罗氏沼虾体内分离出一株优势菌株,接 种于LB弧菌选择培养基,30C培养24 h后,在培养基 上形成菌落表面凸起。光滑湿润。颜色为黄色且有臭 味，菌落直径为1.4-2.0 mm(图1)的革兰氏阴性菌落(图2),溶血实验证明该分高菌株为型溶血(图3)..22生理生化特性

该分离菌株的生化反应详细结果见表1.根据表l可以看出,氧化醒,阿拉伯糖﹒葡萄糖产酸、蛋白陈 水.精氨酸水解醒.明胶,苯丙氮酸为阳性:疏化氢.丙 二酸盐.赖氦酸脱羧酯,鸟氮酸脱羧酯,枸缘酸盐.V- P.葡萄糖酸盐为阴性。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》 和《常见细菌系统鉴定手册*可初步确定该分离菌 株为豚鼠气单胞菌。

2.3药敏试验

结果表明(表2,该病原菌对头孢曲松.氯霉素、 氟苯尼考,四环素、多西环素5种药物高度被感,对卡 那霉素Ⅰ种药物中度敏感,对环丙沙星.诺氟沙星.红 霉素.阿奇霉素.新生霉素.链霉素.复方新诺明和利福 平8种药物耐药。

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