反式肉桂醛对副溶血性弧菌的抑制作用

副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)是一种 无芽孢.无荚膜、有鞭毛.能运动的短杆或弧杆状的 革兰氏阴性细菌,属于弧菌科弧菌属"。副溶血性弧 菌是一种嗜盐菌,可在含盐量为0.5%-8%的环境中 正常生长四,广泛分布于近岸海水、海底沉积物和海 产品中心,其在海产品中的检出率夏季(7-9月份)可 高达50%以上4,其中虾类、鱼类和贝类受副溶血性 弧菌污染尤其严重”。

近年来,随着经济的发服和人民生活水平的不 断提高,海鲜食品逐渐进人内陆,产销量逐年增加， 由剮溶血性弧菌引起的食物中毒事件也呈逐年上 升趋势网。副溶血性弧菌引起的食源性疾病--般为 急发病,潜伏期2~24h。人体感染副溶血性弧菌后, 轻者会出现以恶心、呕吐或腹痛为主要症状的急性 肠胃炎"，重者可能会脱水、休克、昏迷甚至死亡啊。 据统计,在东南亚国家,约50%的肠胃炎是由副溶 血性弧菌引起的;在美国、欧洲地区,副溶血性弧菌 也是危害公众健康的主要致病菌之一,其感染发生 率逐年增加”:在中国,由副溶血性弧菌引起的食物 中毒事件在数量上已超过沙门氏菌中毒案例(2012 年报道)，副溶血性弧菌已成为首要的食源性致病 菌呵。由此可见,副溶血性弧菌引起的食物污染在世 界范围内严重危害着公众的健康安全。

为降低海产晶中副溶血性弧菌的污染风险,目 前应用的控制指施主要包括辐照保鲜、气调保鲜、 化学防腐剂保鲜以及生物保鲜等技1术0-。辐照保 鲜和气调保鲜虽然能够很大程度地保留食品的营 养和香味,但其缺点在于对技术及工厂方面安全防 护揩施的要求高。实际应用成本也较高1+9:化学防 腐剂虽然有良好的抑菌效果,但易使菌体产生耐受 性，而且有可能改变食晶的自然风味和质构,往往 具有潜在毒性，不被消费者接受啊。因此寻求安全、 有效的控制海产品中副溶血性弧菌的方法具有重 要意义。近年来,植物源活性物质因具有天然、安全 和营养等优点面受到广泛关注叮，越来越多的研究 者将目光投向天然植物源活性物质抑制食源性致 病菌14.19。

肉桂醛是肉桂精油的主要活性成分，主要存在于闵桂树皮,它在自然界中的天然存在形式为反式 肉桂醛(C9H8O, trans-cinnamaldlehyde ,TCI。反式 肉桂醛已被美国食品药品监督管理局(Food andl Drug Adlministration,FDA）列为公认安全的食品成 分(Generally Hecognized as Safe , GRAS)。反式肉桂 醛作为一种食品添加剂，已被应用于多种食品中， 如口香糖.冰淇淋.糖果和饮料等,它还可以与山毛 桦坚果壳衍混合成商品化的囱桂桥，用于面包﹑蛋 糕及其他烘焙产品案。据报道,反式肉桂醛具有抗 癌<抗炎和治疗糖尿病等多种生理功能凹,并且其已 被证实对多种致病菌如金黄色葡萄球菌.肠出血性 太肠杆菌O157;H7和沙门氏菌具有良好的抑制作 用P-4,但目前反式肉桂醛对海产品中副溶血性弧 菌的抑制作用及抑菌机理却尚未研究.

因此,作者以副溶血性弧菌为检测对象﹐首先 通过测定反式肉桂醛对副溶血性弧菌的最小抑菌 浓度,评价其抑菌效果;其次通过测定反式肉桂醛 对副榕血性弧菌生长曲线.生长动力学参数.细胞 膜完整性和细胞形态的影响，探究其抑菌机理;最 后通过构建副溶血性弧菌污染的鲜虾模型,评价反 式闳桂醛对鲜虾中副溶血性弧菌的控制作用,旨在 为反式肉桂醛作为一种植物源抑菌剂用于控制海 产品中副溶血性弧菌的污染提供理论依据。

1 材料与方法

1.1菌种.培养基、试剂与鲜虾

副溶血性弧菌〔Vibrio parahemolyticus}标准菌 株ATCC 17802.ATCC33847:购于美国模式培养物 集存库(Armerican type culure collection ,ATCC);副 溶血性弧菌分离菌株241.245.247.249:由香港理 工大学食物安全及科技研究中心分离自鲜虾。NaCl牍蛋白称大豆琼脂培养基:胰蛋白球15 g-植物蛋白陈5g~氟化钠30g.琼脂15g,加蒸馏 水定容至1L，加热煮隐至完全溶解后,121 ℃高压 灭菌15 min备用;3 gdL.NaCI胰酪腺大豆肉汤培 养基(3 g/dLNaCl Tryplone Soya Broth ,3 gfdL.NaCl TSB）:陆蛋白陈17g.植物蛋白陈3g.氟化钠30 g. 磷酸氢二钾2.5g.葡萄糖2.5g,加蒸馏水定容至ⅠL.加热煮沸至完全溶解后,121 C高压灭菌15 min 备用。

反式肉桂醒(rans -cinnamaldehyde ,HPLC≥99%):购于美国Sigma试剂公司;LIVE/DEAD9 BaeLighr"细菌活性检测试剂盒:购于赛默飞世尔 科技公司;二甲基亚假(DMSO, HPLC≥99.5%):购 于天津市科密欧化学试剂有限公司;试验所用其他 试剂:均为国产分析纯。鲜虾:购于陕西省成阳市杨凌示范区盛世阳光超 市,鲜活低温条件运回实验室,平均体长(70+0.5) cm, 平均体重(4.44+0.25) g。

1.2仪器与设备

微生物全自动生长曲线分析仪:芬兰Bioscreen 公司产晶;低温冷冻商心机5804R:德国Eppendorf 公司产品;多功能微孔板检测仪MicroplateReaders Spectra Max M 2:美国Molecular Derices公司产品; 激光共聚焦显微镜Nikon Al:日本Nikon公司产品; 场发射扫描电镜S--4800:日本Hitachi公司产品。

1.3 方法

1.3.1茵株活化与商悬液制备

将-80 C保存的副 落血性弧菌菌株(ATCC 17802 、ATCC 33847.分离 菌241 245.247.249)划线于3 gdL NaCl TSA培养 基,经37 C恒温培养12 h后,分别挑取单菌落接种于3 glIL NaCI TSB肉汤.置于37 C恒温摇床(120 r/min) 培养12h。随后,将菌悬液离心(4 C 8 000g.离心10min)，使用无菌磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffer Solution, PBS,pH 72)清洗菌体两次,离心参数 设置同前。随后使用PBS溶液调整菌悬液600mm处 吸光度值(0D2..)为05(菌悬液浓度约10* CFU/mL) 备用。

1.3.2反式肉桂醛对蒯溶血型弧菌最小柳茵浓度 的测定试验

参照Yousef等(2013)門的方法,略有 修改。在24孔板的第一一个孔中加人1 mL.45-55 C 经高温高压灭菌的3 g/dL. NaCl TSA培养基,将反式 肉桂醛加人至第-个孔，充分吹打混匀,使其质量 浓度为200μg/ml.随后使用3gdL.NaCl的TSA在24孔板中逐步稀释,使反式肉桂醛终质量浓度分别 为140,100.70 .50.35和25 μg/mL (每孔终体积为0.5 mlL, DMSO质量分数为0.5%)。以不添加反式肉 桂醛的3gdL NaCl TSA培养基(含质量分数0.5% DMSO)为阴性对照组,以添加卡那霉素(0.1mg/mL) 的3gdLNaClTSA培养基为阳性对照组。待琼脂冷却凝固后,分别取13.1中制备的菌悬液2 μL接种 至24孔板各孔中央,将样品置于37 C培养箱,24 h 后观察。试验将经过24h培养后肉眼观察无明显菌 落生长的最低反式肉桂醛质量浓度作为最小抑菌 浓度(Minimum Inhibitory Concentration , MIC)。

1.3.3反 式肉桂醛对副溶血型弧菌生长曲线的影 响试验

选取副溶血型弧菌ATCC 17802进行后续 研究。参照Silvaangulo等(2014)P的方法,将1.3.1 中制备的副溶血性弧菌ATCC 17802菌悬液离心(4C8 000g,离心10 min)，使用无菌3 g/dL. NaCl TSB 肉汤将菌体清洗两次。随后使用3 g/dL. NaCl TSB 调整菌液0Daw=0.5,并使用3 g/dL NaCl TSB肉汤 將菌液稀释100倍(约10* CFU/mL)。在蜂窝板每孔 中加人125 μL菌悬液。随后，向蜂窝板每孔加人125 μL使用3 g/dL. NaCl TSB肉汤溶解的反式肉桂 醛溶液，使反式肉桂醛终质量浓度分别为MIC、1/2MIC、14MIC.1/8MIC.1/16MIC、1/32MIC.试验设 置不含反式肉桂醛的菌悬液(含0.5% DMSO)作为. 对照组，同时设置3g/dLNaClTSB肉汤(含0.5%. DMSO)作为背最空白对照组,每组设置6个平行。 将样品置于Biocreen全自动生长曲线分析仪，于37 C下每隔1小时测定24h内各孔吸光度值,绘 制生长曲线。

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