常压室温等离子体诱变技术选育曲霉型豆豉发酵菌种研究（二）

7、突变株与原始菌株的生长性能及产蛋白酶系活力对比实验

（1）菌落形态对比实验

取活化好的突变株和原始菌株试管斜面，分别用牙签点种于PDA培养皿中心，30℃静置培养，每隔24h观察菌落形态变化，在无菌室超净工作台拍照记录。

（2）微观形态对比实验

采用载玻片培养观察法，在培养期间每隔12h取出突变株与原始菌株载玻片，置于显微镜下观察并对两者的微观形态进行比较。

（3）产孢子能力对比实验

孢子含量测定参照种曲孢子数测定法。

取活化好的突变株和原始菌株的孢子悬浮液（107CFU／mL）按1.0％接种于种曲培养基中搅拌均匀，在32℃的培养箱中堆积培养。培养至15h后，将曲料打散进行第一次摇瓶，并降温至30℃平铺培养。大约22h后，将曲料打散后接着平铺培养，期间在第36、48、60、72和84h进行取样，测定两者孢子含量。

（4）蛋白酶系活力对比实验

将K值较大的18株初筛菌株活化，制备孢子悬液并稀释至10⁷CFU／mL。根据曲霉型豆豉浅盘制曲工艺，按照1.0％的接种量，前期发酵温度控制在30～34℃，制曲至第18～24h，豆粒表面布满白色菌丝，进行第一次翻曲；当曲醅出现嫩黄孢子时，进行第二次翻曲，温度控制在28～32℃。培养至72h取样，采用SB/T10317—1999中的福林酚法测定各菌株曲醅中性蛋白酶活力fl突变株和原始菌株制曲期间，在第24、36、48、60、72和84h进行取样，蛋白酶活力（中性、碱性及酸性蛋白酶）测定采用SB/T10317一1999中的福林酚法。

8、数据统计

本研究实验数据用EXCEL软件进行基本处理，并用SPSS20.0软件的0ne—WayANOVA对其显著性进行分析；用Origin9.0软件进行绘图。

二、结果与分析

1、米曲霉致死率曲线绘制

由图1可知，随着ARTP诱变时间的延长，其所产生的损伤作用可使菌体致死率不断升高，在0～1min菌体致死率上升明显，2～7min上升幅度不断减小，7min以后致死率接近100％，本实验致死曲线的整体走势与ZhangN、司晓光报道的“马鞍型”存活曲线非常吻合。当处理时间为3min时，“马鞍型”致死曲线出现拐点的原因可能是诱变时间的增加导致ARTP对DNA的损伤作用加强，促使菌体启动SOS修复机制，其诱导产生DNA聚合酶IV和V对DNA链损伤部位的碱基错配不具备校正功能，SOS不精确修复触发菌体生物反应细胞中复杂的调控网络，造成遗传物质及代谢途径的改变，以此来应对ARTP损伤刺激，菌体致死率下降。但当损伤强度超过菌体修复机制的极限时，菌体便会大量死亡，因此7min以后菌体致死率接近100％。

2、初筛结果

点种在于考察优良菌株是否能在密集的培养中仍能维持较高的中性蛋白酶活力，并且要求菌株的生长速率快，对环境适应力强。菌株正突变表现为菌落长势好并且K值比对照值大。由表1可知，18株初筛菌株的K值均大于原始菌株，其产中性蛋白酶能力可能优于原始菌株，其中菌株NCU—A38、NCU—A55、NCU—A17菌落长势较好，且透明圈直径最大，分别为25.6、23.5、23.5mm，而它们的K值则分别达到了2.08、2.04、1.77。袁艳玲研究表明，依据K值筛选正突变株效率高，但菌株的产中性蛋白酶能力与K值并不是呈规律的线性相关。因而需要进一步的复筛来确定最终高产中性蛋白酶活的突变株，实验采用浅盘制曲测定中性蛋白酶活予以验证。

3、复筛结果

上图结合表1可以看出，原始菌株和18株初筛菌株中性蛋白酶活力大小与K值的关系：总体上，酶活力随K值的增大而增大，比如突变株NCU—A38、NCUA55、NCU—A17的K值较大，并且其酶活也显著高于其他菌株（JP＜0.05）。其中突变株NU—A38中性蛋白酶活力最高，为765.4U/g，提高了25.0％，突变株NCU—A55、NCU—A17酶活也分别提高了21.0％、17.0％，效果显著。但有些K值较大的菌株比如NCU—A9、NCU—A21，中性蛋白酶活力并不高。本实验结果与李鹏等人采用紫外诱变选育氨肽酶高产菌株的研究结果大体相同，有些初筛K值较大的菌株在经复筛后其酶活性反而不高，由此这也说明了复筛的必要性。根据复筛结果，选取NCU—A17、NCU—A38、NCU—A55三株中性蛋白酶活力显著提高的突变株进行遗传稳定性验证实验，最终确定出性状优良的菌株。

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