基于环介导等温扩增技术的产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌特异性检测（二）

2结果与讨论

2.1 LAMP特异性

为了验证所建立产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌LAMP方法的特异性，本研究将设计的LAMP引物分别扩增2株产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌、19株蜡样芽胞杆菌和41株非蜡样芽胞杆菌的基因组DNA，检测结果如表2所示。其中2株产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌均为阳性，显色反应呈现绿色；19株蜡样芽胞杆菌和41株非蜡样芽胞杆菌均为阴性，显色反应呈现橙色。说明该LAMP引物仅针对产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌cesB基因产生特异性扩增，对蜡样芽胞杆菌、苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、沙门氏菌等的DNA未产生扩增反应，LAMP扩增的特异性良好，可用于产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的特异检测。

2.2 LAMP灵敏度

2.2.1 DNA灵敏度

用DNA抽提试剂盒抽提产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌F4810/72基因组DNA，用酶标仪测定DNA的浓度为124 ng/μL。将上述DNA进行梯度稀释，进行LAMP扩增结果表明，LAMP的灵敏度为1.49 pg/μL（图1）。这与徐匆等（2020）建立的单增李斯特菌的LAMP基因组灵敏度相当。

2.2.2纯菌灵敏度

培养产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌F4810/72，纯菌原始浓度为5.0×108CFU/mL，梯度稀释，分别取不同稀释度菌悬液提取DNA，LAMP检出情况见图2。LAMP纯菌灵敏度为5.0×103CFU/mL。杨滴等建立了蜡样芽胞杆菌的实时荧光定量PCR，其纯菌灵敏度为1.0×103CFU/mL，与本研究的灵敏度相当。周巍等建立了LAMP技术检测酸乳中蜡样芽孢杆菌，其纯菌灵敏度为6.4 CFU/mL，高于本研究的灵敏度。

 2.3人工污染样品检测

培养产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌F4810/72，人工污染米饭的接种浓度分别为2.0×100、2.0×101、2.0×102、2.0×103CFU/g，0、2、4和6 h后分别取样品增菌液用试剂盒和煮沸法提取DNA，LAMP检出情况见表3和图3。当起始污染菌量为2 CFU/g时，37℃增菌培养6 h，用试剂盒法和煮沸法提取的DNA，都可以检出产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌。Martina（2007）等建立了产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的实时荧光定量PCR。产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌人工污染米饭，经过6 h增菌，煮沸法提取DNA，灵敏度为100CFU/g，本研究建立的LAMP体系灵敏度与其相当。张志鸿等（2014）同样建立了产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的实时荧光定量PCR，产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌人工污染米饭，经过2 h增菌，灵敏度为100CFU/g，高于本研究中的2CFU/g，但该研究需要使用特定的荧光定量PCR仪器和专业人员操作，不利于在基层检测实验室大规模推广使用，无法满足现场检测的要求。当起始污染菌量大于2.0×103CFU/g时，不用经过增菌培养，LAMP可直接检测出产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌。Zhang（2014）等建立了产呕吐毒素和非呕吐毒素的蜡样芽胞杆菌多重PCR，人工污染食品，不用经过增菌培养，其灵敏度为3.6×103CFU/g，与本研究的灵敏度相当。

综上所述，在大批量实际样品检测时，可以采用煮沸法提取DNA，从而节省时间和试剂。当产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌污染食品的浓度超过103CFU/g时，不需要增菌培养过程，可以直接检出，从而缩短了检测周期。由于食用蜡样芽胞杆菌数量大于105CFU/g时有可能引起食物中毒甚至死亡，因此可以用本研究开发的LAMP方法直接快速筛查产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌，排查其风险。

2.4食品中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的检测

72份食品样品用传统方法检出2份产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌阳性样品，包括一份熟食和一份巴氏奶。直接用LAMP检测72份食品样品，也检出2份产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌阳性样品，且同传统方法一致，但比传统方法的检测时间大大缩短。

3结论

本研究首次建立了基于cesB基因的产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌LAMP检测方法。建立的方法具有特异性强、快速的优点。在基因组DNA水平的灵敏度为1.49 pg/μL，纯菌灵敏度为5.0×103CFU/mL。人工污染米饭样品，当起始污染量为2 CFU/g时，37℃增菌培养6 h，即可检出。当产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌污染食品的浓度超过103CFU/g时，不需要增菌培养过程，亦可以直接检出。本研究建立的LAMP技术可应用于食品样品中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的快速筛查检测，简便快捷，具有较好的推广应用前景。
 

声明：本文所用图片、文字来源《现代食品科技》2020年12月8日，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

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