肠道集聚性大肠杆菌基因组脱氧核糖核酸提取方法比较与改进（二）

3分析与讨论

3.1不同试剂盒对集聚性大肠杆菌基因组的提取效果

分别吸取1 mL培养过夜的集聚性大肠杆菌菌悬液，按照4种细菌基因组提取试剂盒提供的标准方法提取集聚性大肠杆菌基因组，不同试剂盒分别提取的集聚性大肠杆菌基因组纯度及浓度见表4。基因组质量浓度在10.8~30.4 mg/L，天根试剂盒提取的基因组DNA的质量浓度最低，只有10.8mg/L；宝生物试剂盒提取的质量浓度最高，但也仅为30.4 mg/L。纯净的基因组DNA的260 nm处的吸光度A260与280 nm处的吸光度A280的比值1.8，较纯净的基因组DNA的A260与230 nm处的吸光度A230的比值大于2.0，所提取的基因组DNA的A260/A280的值小于1.66，可能样品有蛋白质污染；A260/A230的值小于1.12，推测基因组DNA样品可能含有有机试剂或盐离子等污染物。

琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。4种试剂盒所提取的基因组条带完整性良好，无核糖核酸(RNA)污染，但是用4种方法所提取的基因组的浓度均较低。制备核酸标准样品时前期的基因组样品提取工作将耗费大量的资源，为提高产率，需要对提取步骤进行必要的优化。从使用4种试剂盒提取EAEC基因组DNA的提取工作耗时由短到长的顺序是宝生物、天根、全式金、OMEGA，其中OMEGA试剂盒提取过程耗时最长，天根试剂盒提取浓度过低。从试剂盒购买价格考虑，OMEGA试剂盒（50次）花费648.00元，而天根试剂盒（50次）花费420.00元；但是该试剂盒需自备RNase A，总费用合计720.00元，在4种试剂盒中价格最高，因此，后续研究将对宝生物试剂盒及全式金试剂盒标准提取方法进行优化。

3.2宝生物试剂盒提取集聚性大肠杆菌基因组方法优化

使用宝生物试剂盒标准提取方法中的革兰氏阳性菌提取方法，并且增加了对于菌悬液的处理过程。取1 mL培养过夜的EAEC菌悬液，离心分离弃上清后加入500µL的Buffer BS试剂，加入溶菌酶至终质量浓度为2 g/L。在第一步的材料处理时加入蛋白酶K后在56℃的孵育时间由原来的30 min延长至40 min。

优化后宝生物试剂盒提取的EAEC基因组的纯度及浓度见表5。优化后宝生物试剂盒提取的EAEC基因组的质量浓度为34.1 mg/L，与优化前的提取质量浓度30.4mg/L相比，浓度提高较少，提取过程耗时较优化前增长了1.5 h，基因组A260/A280及A260/A230的值低于优化前。电泳分析结果如图2所示。可以看出，优化后提取的基因组条带清晰，无RNA污染，说明优化后提取基因组效果未能达到快速提取大量高质量基因组的目的。

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