7种芸香科植物精油抑菌活性的研究

芸香科植物资源丰富，广泛分布于全球热带和温带地区，芸香科柑橘属果实产量丰富。在中国以南方栽培较多，物尽其用后的皮、瓢等有一定的药用价值，其中柚，橘和柠檬等芸香科果皮利用率较低，而这些果皮如果没有得到妥善处理将会给环境带来严重负担，若对其进行废物利用可以大大提升它的价值。目前病原细菌耐药性的问题日渐突出，对高效安全的抗菌药物的研发和应用提出了更高的要求和迫切希望。对植物精油进行抗菌活性成分的研究，有利于植物资源的开发和利用，从中寻找具有抗菌活性的物质，有利于新农药、医药以及食品保鲜防腐剂的研发和创新。
因此，本研究将以7种常见的芸香科植物为原料，以此提炼出精油。进一步测定单种及复合精油对几种重要细菌的抑菌活性。本研究所选择材料均为可食用，毒性较小。为探索和开发用于食品领域的复合精油抑菌产品提供理论依据。

一、材料与方法

1、材料

植物材料：柠檬、砂糖橘、桠柑、丑柑、脐橙采自成都市,蜜柚、花椒采自德阳市；

试剂：DMSO（二甲基亚矾，分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、氯化钠（分析纯）、牛肉膏（生化试剂）、营养琼脂（生化试剂）、蛋白陈（生化试剂）购自北京奥博星生物技术有限责任公司；硫酸链霉素（分析纯）购自君威生物科技公司；75%乙醇（分析纯）购自四川省伊洁士医疗科技有限公司。

2、菌株

供试菌株：白色葡萄球菌（Staphylococcusalbus）ATCC8799、表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis）ATCC35984、金黄葡萄球菌（Staphylococcusaureus）ATCC6538、大肠杆菌（Escherichiacoli）ATCC65922、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）ATCC6633、伤寒杆菌（Salmonellatyphi）ATCC14028，由成都大学医学院提供。

3、微生物培养基

营养肉汤（NB）液体培养基配制：氯化钠5g，蛋白胁10g，牛肉膏3g，去离子水1000mL,调节pH至7.2，分装到100mL三角瓶中，每瓶装50mL，121℃灭菌待用﹔营养肉汤固体培养基配制：在液体培养基的基础上添加15%琼脂，121℃灭菌待用，用于细菌接种活化。

4、仪器

UPT-II-20T型优普系列超纯水器：成都超纯科技有限公司；LT202B电子天平：常熟市天量仪器有限责任公司；LDZM-40KCS型立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；DH-360A电热恒温培养箱：北京中兴伟业有限公司；SW-CJ-1F超净工作台：苏州净化。

5、实验方法

（1）植物精油的提取

柠檬、脐橙、蜜柚、丑柑、砂糖橘、桠柑去皮后，去除白色底部部分，将皮在粉碎机中捣碎，在-4℃下保存。称取一定量的材料，按照料水比1∶8（m/v）的比例，采用水蒸气蒸馏法提取其挥发性成分，微沸状态下提取精油，每次持续5h，收集精油。7种芸香科植物每种提取2kg材料，计算精油得率。

（2）抗细菌活性检测

①细菌最低抑制浓度（MIC）的测定精油系列浓度溶液配制：分别称取80mg精油溶于一定量7%DMSO溶剂中，超声助溶，用相应试剂补充至1.0mL，配成80mg/mL的母液，然后用7%溶剂将其依次稀释，分别配制成40mg/mL、20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL系列溶液，4℃保存。用于细菌活性测定的阳性对照为硫酸链霉素，配方如下：称取2mg硫酸链霉素溶于1.0mL乙醇中，配成2mg/mL的母液，然后用7%乙醇稀释，使浓度为1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL，4℃保存。

最低抑菌浓度测定：用移液枪吸取0.5mL已活化好的细菌接种至50mL新鲜的营养肉汤液体培养基中，将菌液浓度调至0.5麦氏管，约10CFU/mL，取上述菌液200uL加入到无菌的小试管中，再添加200uL系列浓度的药液，阴性对照加相应溶剂，阳性对照加相应的抗生素，不作添加的孔为空白对照，每个处理3个重复。在37℃培养箱中培养24h，以细菌不生长的试管或不浑浊试管所对应的药剂浓度即为MIC值（最低抑菌浓度）。

②细菌最低杀菌浓度（MBC）的测定按照上述方法，配制MIC，2MIC，和4MIC浓度的系列精油溶液。用移液枪吸取0.5mL已活化好的细菌接种至50mL新鲜的营养肉汤液体培养基中，取上述菌液200uL加入到无菌的小试管中，加入200uL系列浓度精油溶液，37℃培养24h。吸取MIC孔及更高浓度孔的菌液，用接种环涂板检测培养24h，未长出细菌菌落的精油溶液浓度则为MBC（最低杀菌浓度）。阴性对照加相应溶剂，阳性对照加相应的抗生素，不作添加的孔为空白对照，每个处理3个重复。

③复配精油抑菌活性根据上述抑菌活性的结果，选择出柠檬＋蜜柚，柠檬＋花椒按照不同比例进行复配，测定复配精油的抑菌活性。用移液枪吸取0.5mL已活化好的细菌接种至50mL新鲜的营养肉汤液体培养基中，将菌液浓度调至0.5麦氏管,约106CFU/mL；取上述菌液200uL加入到无菌的小试管中，再分别添加两种精油各100uL系列浓度的药液，阴性对照加溶剂，阳性对照加相应的抗生素，不作添加的孔为空白对照，每个处理3个重复。在37℃培养箱中培养24h,观察各试管中细菌生长情况，以“+”表示有细菌生长，以“一”表示未见细菌生长。计算分级抑菌浓度指数（FIC）。FIC指数=（MIC_{A精油联用}/MIC_{A精油单用}）+（MIC_{B精油联用}/MIC_{B精油单用}）若FIC指数≤0.5，协同作用﹔0.5＜FIC指数≤1，相加作用﹔1＜FIC指数≤2，无关﹔FIC指数＞2，拮抗作用。

二、结果与讨论

1、7种芸香科精油得率

采用水蒸气蒸馏法提取柠檬、蜜柚、花椒、桠柑、丑柑、脐橙、砂糖橘挥发性成分，根据公式计算提取得率，结果见表1。由表1可见，花椒精油得率最高，为2.47mL/100g，其次为蜜柚精油，得率为1.43mL/100g，丑柑精油得率较低，仅为0.3mL/100g。

2、精油抑菌活性结果

本研究采用微量肉汤稀释法，测定柠檬,蜜柚等7种芸香科植物精油对6种常见致病细菌的抑菌活性，结果见表2和表3。结果显示，在一定浓度下，大多数精油对供试细菌的生长具有抑制作用。柠檬、花椒、碰柑和脐橙精油对3株葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及伤寒杆菌的生长均表现出不同程度的抑制活性。其中，柠檬精油对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制活性较好，MIC值均为5mg/mL。柠檬精油在10mg/mL浓度能够杀灭大肠杆菌。蜜柚精油在浓度为10mg/mL时，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、伤寒杆菌以及大肠杆菌均有很好的抑制作用，其中对大肠杆菌活性较好，MBC值为10mg/mL。总体而言，除了丑柑精油外，其余6种精油对大肠杆菌均表现除了不同程度的杀灭活性，MBC在20～40mg/mL不等。
 

复配精油抑菌活性结果表明（见表4、表5），经过复配后，复合精油对大肠杆菌抑制作用存在差异性。经计算，柠檬与蜜桔精油，柠檬与花椒精油，两组复合精油FIC均为6（＞2），柠檬精油无论与蜜柚或花椒均存在拮抗作用。

三、结论

四川省内芸香科植物资源丰富，为植物精油的提取提供了充足的原料。研究表明，植物精油有广谱高效的抗菌活性,绿色环保，来源广，提取容易。植物精油，在抗菌领域具有巨大的潜在应用价值。本研究采用水蒸气蒸馏法提取柠檬、脐橙、蜜柚、丑柑、花椒、砂糖橘、碰柑7种芸香科植物中的挥发油成分，通过抗菌活性检测测定7种植物精油抑菌活性。从得率来看，其中花椒精油得率最高，其次为蜜柚皮精油，脐橙皮精油得率居第三位，表明这三种材料精油含量较高，易于获取，为可开发利用的潜在资源。

大部分芸香科精油对3株葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌和枯草芽孢杆菌的生长均表现出不同程度的抑制活性。常见食品污染菌大肠杆菌对本研究的大部分精油较敏感。其中，柠檬、蜜柚精油对大肠杆菌表现出较强的抑菌活性。此外，柠檬精油对枯草芽孢杆菌表现出较强的抑菌活性。复配精油抑菌活性结果显示，柠檬与蜜柚精油，或者是柠檬与花椒精油经过不同浓度配比后，复合精油的抑菌活性效果具有差异性。组内成分存在相互拮抗作用，芸香科植物可能不适合进行同科复配，效果比单种精油更弱。本研究促进了对芸香科单方精油和复方精油在抑菌性能上的了解，为植物精油作为食品防腐剂的开发奠定基础，也可为下一步开发复合精油抑菌产品的研发提供思路。

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