乳链球菌素最小抑菌浓度（MIC）测定及理化性质分析（一）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）是导致食品污染的一种重要病原菌，可引起多种严重感染。据报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染仅次于大肠杆菌排世界第二，侵袭性酶、毒素是金黄色葡萄球菌的致病的关键所在。该菌广泛分布于空气、水、灰尘及人畜粪便中，因此容易污染食品。

乳酸链球菌素（nisin）是一种乳酸菌的次级代谢产物，它是由34个氨基酸组成的阳离子多肽，具有良好的抑菌活性，尤其对于革兰氏阳性细菌有很强的抑菌效果，是世界卫生组织公认安全的天然生物食品防腐剂。目前对其抗菌机理的研究比较充分，主要是孔道理论，即nisin与靶细胞的细胞壁前体脂质（LipidI）结合进而插人到细胞膜并形成孔道，从而破坏靶细胞膜的完整性而引起细胞离子和小分子的外排而使细胞死亡。随着人们对食品安全意识的逐渐提高，对化学类食品添加剂负面影响的了解，对与健康相关的食品添加问题也越来越受消费者的关注。因此，nisin作为一种理想的天然防腐剂在食品行业中备受青睐。为探索nisin在食品工业中广泛应用，除必须对其抑菌机理进行充分研究外，对其最小抑菌浓度及理化性质的研究也是一个重点。

本研究以金黄色葡萄球菌作为指示菌，采用二倍梯度稀释法测定nisin的最小抑菌浓度；并利用琼脂平板扩散法探究其理化性质，包括温度、pH、蛋白酶及表面活性剂对nisin抑菌活性的影响。

一、材料与方法

1、试验材料

（1）试验试剂

Nisin（分析级，Sigama公司）；蛋白酶K（美国Tiangen公司）；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶（Sigama公司）；金黄色葡萄球菌（StaphylococcusaureusATCC6538P）来源于中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）；十二烷基硫酸钠SDS（上海生工）；Triton-100（上海生工）；Tween20（上海生工）。

（2）仪器与设备

恒温培养箱：上海市跃进医疗器械一厂；冷冻干燥机：Hetosicc公司；酶标仪：MolecularDevices公司；DK-SD型电热恒温水槽：上海一恒科技有限公司；ZHJH--C1109B超净台：上海智诚分析仪器制造有限公司；Centrifuge5804R台式高速冷冻离心机：Eppendorf公司；96孔板：Sigama公司；打孔器：直径为10mm；0.22μm无菌滤器：Millipore公司。

（3）培养基和缓冲液

LB液体培养基：蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl1%溶于蒸馏水中，搅拌均匀于121℃灭菌备用；LB固体培养基（琼脂0.75%）；几种缓冲液：pH为2（50mmol/L甘氨酸—HCl）、4（50mmol/LNaAC—HAC）、6（50mmol/LMES—NaOH）、7（50mmol/LNaH₂PO₄—NaHPO₄）、8（mmol/LTris—HCl）、9（50mmol/L甘氨酸—NaOH）、10（50mmol/L甘氨酸-NaOH）、11（50mmol/L甘氨酸—NaOH）缓冲液。

2、试验方法

（1）nisin最小抑菌浓度（MIC）的测定

准确称量适量nisin粉末，溶解于无菌水中，配成一定浓度的溶液。采用二倍梯度稀释法测定nisin的最小抑菌浓度，用无菌蒸馏水进行梯度稀释。对数期的指示菌金黄色葡萄球菌用LB培养基梯度稀释至10⁵CFU/mL，分别取90μL该菌液于96孔板的第2～11孔中，每孔再加入10uLnisin梯度稀释液。而第一孔加90uLLB培养基和10μL无菌水作为阴性空白对照，第十二孔加90μL稀释后的金黄色葡萄球菌菌液和10μL无菌水为阳性空白对照，上述过程15min内做完，做三个平行。混匀后将96孔板置于培养箱中37℃培养18h，取出后打匀，并用酶标仪测定，OD₆₀₀。以nisin浓度为横坐标，以OD₆₀₀值为纵坐标做曲线，拐点为最小抑菌浓度。

（2）nisn理化性质分析

①抑菌半径的测量

抑菌活性的测定采用琼脂平板扩散法。抑菌活性强弱用抑菌半径表示，抑菌半径=（抑菌圈外沿直径D-打孔器直径d）/2，单位mm。

②pH对nisin抗菌活性的影响分别称

取等量的nisin粉末溶解于等量的梯度缓冲液中（pH分别为2、4、6、7.8、9、10、11），混匀于室温下静置4h后过滤器除菌备用。以各个梯度的缓冲液为空白对照，利用琼脂平板扩散法在金黄色葡萄球菌抑菌板上检测抑菌活性，每个pH梯度做三个平行。用游标尺测量抑菌半径，以pH为x轴，以抑菌半径为y轴做柱状图。

③温度对nisin抗菌活性的影响分别取

等量同浓度的nisin溶液置于常温、40、60、80、100、120C处理30min，待冷却后用13，000r/min离心15min，上清过滤器后用琼脂扩散法检验抑.菌活性，每个温度梯度做三个平行，测量并计算出抑菌半径后做图。

④蛋白酶对nisin抗菌活性的影响

分别使用三种蛋白酶（胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K）处理nisin溶液，其中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K处理的终浓度分别为50μg/mL、1mg/mL、1mg/mL，分别置于37、37、55℃作用1h，三组不加酶的样品也分别置于相同条件下处理作为对照。每个酶处理做三个平行，反应结束后用13，000t/min离心10min，取上清过滤器并检验抑菌活性，测量并计算出抑菌半径后做图。

⑤表面活性剂对nisin抗菌活性的影响

分别用SDS、Triton-100、Tween20处理同浓度nisin溶液，使抗菌蛋白中三种表面活性剂的含量为分别为0.01%、0.05%、0.05%，在室温下作用3h，每组做三个平行。作用后用13，000r/min离心10min，取上清过滤器并检验抑菌活性，测量并计算出抑菌半径后做图。

二、结果与分析

1、nisin最小抑菌浓度（MIC）

不同质量浓度的nisin对金黄色葡萄球菌的抑制作用如图1所示，在nisin质量浓度为37.50、18.75、9.38、4.69、2.34μg/mL时，OD值基本趋于零，说明在该浓度梯度下，金黄色葡萄球菌的生长受到抑制。当nisin质量浓度降低为1.17μg/mL时，OD值急剧升高，且随着nisin浓度继续降低OD值增大显著。由此判断该浓度拐点2.34μg/mL为nisin对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度。
 

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