奶粉中沙门氏菌和阪崎肠杆菌的测定能力验证结果分析（一）

1引言

沙门氏菌属(Salmonella)是条件性细胞外寄生的革兰氏阴性肠杆菌，在食品和水中可存活5个月至2年之久， 是食源性疾病的主要致病菌之一。食源性疾病尤其是微生物污染是我国食品安全的首要问题。自2010年我国实施食品安全风险监测以来，沙门氏菌始终是食源性疾病重点监测的常见病原菌之一，且检出率较高，如在肉及肉制品中其检出率高达50%以上。沙门氏菌的耐药性已经出现，且人源性和畜禽源沙门氏菌耐药性存在着明显差异。食品加工从业人员仍然存在着不同程度的沙门氏菌带菌状况。在部分地区，沙门氏菌引起的食源性疾病呈现出了逐年上升的趋势。因此，对沙门氏菌的的监测和防控不容松懈。阪崎肠杆菌(Sakazakii)是一种周生鞭毛、能运动、无芽孢的革兰氏阴性细菌，可导致新生儿脑膜炎、致死性小肠结肠炎和菌血症等疾病。由于具有一定的耐热、耐干燥性，阪崎肠杆菌的分布较为广泛。

2018年3月，一批荷兰进口奶粉被检出阪崎肠杆菌；岳明祥等报道天津市即食食品抽查中，在盒饭、炒菜、熟制米面制品中均检出阪崎肠杆菌。实践中，样品中经常会受到多种菌的污染，鉴定目标菌时，检验人员受到的能力挑战较大。此外，沙门氏菌属种群多，仅国标GB4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》便列了140种，加之典型菌和非典型菌特点不同，以及部分实验室购买标准菌株较少，使得鉴定的难度增大。目前，沙门氏菌的检测方法主要有传统生化培养 法、免疫学方法( ELASA法)和分子生物学方法(RT-PCR)；后2种方法在快速检测方面优势明显，但对实验室配置要求和耗材成本要求较高。阪崎肠杆菌的检测方法主要有传统生化培养法。如何应用传统生化鉴定技术成功地开展样品中沙门氏菌和阪崎肠杆菌的分离鉴定并获得可靠的结果仍然是国内一些实验室面临的问题。

鉴于此，本研究结合本实验室的实际，及以往在辨别干扰菌的关键控制点知识的经验积累，应用现行国家标准GB4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》和GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》对能力验证考核奶粉样品中的沙门氏菌和阪崎肠杆菌进行了分离与鉴定，并获得了可靠的结果，为相关实验室的检测能力的提高提供参考。

2材料与方法

2.1材料

2.1.1标准菌株

沙门氏菌标准菌株为鼠伤寒沙门氏菌(FCC215009)、阪崎肠杆菌标准菌株为FSCC145010/ATCC29544，均来自广东环凯微生物科技有限公司。

2.1.2样品来源

能力验证样品为白色冻干块状，是人工添加菌株的奶粉样品，包装于真空西林瓶内，由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供。沙门氏菌检测样品为２份，样品编号为W和Q；克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测样品也为２份，样品编号为V和G。

2.1.3培养基、试剂及仪器

缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫酸钠煌绿增菌(TTB)、亚硒酸盐胱氨酸增菌液( SC)、亚硫酸铋琼脂(BS)、木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂、三糖铁琼脂(TSI)、营养琼脂( NA)、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(mL ST-Vm)、阪崎肠杆菌显色培养基、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、和阪崎肠杆菌生化鉴定盒(广东环凯微生物科技有限公司)；沙门氏菌生化鉴定盒、沙门氏菌显色培养基(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)； A~F多价血清、Vi血清(宁波天润生物药业有限公司)。空白奶粉，为自购君乐宝婴幼儿奶粉。MLS-3750型高压蒸汽灭菌器(日本三洋公司)； LRH-250-MS霉菌培养箱(广州市丛源仪器有限公司)； MJX-100B-Z型培养箱(广州市梓兴化玻仪器有限公司)； BSC-1000型生物安全柜(苏州安泰公司)。 

2.2实验方法

2.2.1检验依据

根据国家标准GB4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》对２份样品(W和Q)进行定性检测；根据GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》对２份样品(V和G)进行定性检测。实验中，分别用鼠伤寒沙门氏菌标准菌株和阪崎肠杆菌标准菌株作阳性对照。

2.2.2沙门氏菌的定性检测

(1)前增菌

在生物安全柜无菌操作打开西林瓶盖，立即加入无菌水4mL使块状奶粉水化，轻轻摇动，待充分溶解后，全部吸出转移到无菌225mLBPW增菌液中，再用无菌水重复冲洗西林瓶壁，回收清洗液于BPW增菌液中，共用无菌水20mL。振荡混匀，置36℃培养18h。阳性对照实验，取鼠伤寒沙门氏菌阳性对照工作菌株接种于225mL灭菌过的君乐宝奶粉BPW增菌液中。培养条件同上。

(2)选择性增菌

轻轻摇动培养过的样品混合物，分别取1mLW和Q样品的增菌液均加入装有10mLTTB和10mLSC的三角瓶中进行沙门氏菌选择性增菌，TTB增菌液于(42±1)℃培养24h，SC增菌液于(36±1)℃培养24h。同时做阳性对照样品处理。

(3)平板分离

分别用3mm接种环取TTB和SC选择性增菌液1环， 接种在BS、XLD和沙门氏菌显色培养基上，BS培养40~48 h，XLD和沙门氏菌显色培养板培养(24±1)h。

(4)可疑沙门氏菌菌落的鉴定

用接种针挑取可疑沙门氏菌落接种在TSI斜面，于(36±1)℃培养18~24h，可疑者转种NA和进行血清学鉴定。血清学鉴定：首先检查有无自凝性。在洁净玻片上滴加一滴生理盐水，刮取TSI斜面上可疑菌苔混合于生理盐水滴内，用接种针研磨，使其成为均一性的混浊悬液，将玻片轻轻摇动30~60s，在黑色背景下观察反应(必要时用放大镜观察)，若出现可见的菌体凝集，即认为有自凝性， 反之无自凝性。将生理盐水换成用沙门氏菌诊断血清，做凝集试验。血清鉴定阳性者，进一步按照说明书做其它生化鉴定，具体方法如下：刮取菌苔溶解在2mL无菌生理盐水中， 用接种环搅散成均相，吸取100μL接种到生化鉴定条各小杯中，(36±1)℃培养6h后观察。

2.2.3阪崎肠杆菌的定性检测

(1)前增菌

做法同沙门氏菌前增菌。

(2)选择性增菌

轻轻摇动培养过的样品混合物，分别取1mLV和G样品的增菌液加入装有10mLmLST-Vm的试管中于(40±0.5)℃培养(24±2)h进行阪崎肠杆菌选择性增菌。同时做阳性对照样品处理。

(3)平板分离

取mLST-Vm选择性增菌液1环接种在阪崎肠杆菌显色培养基上，倒置于(36±1)℃培养(24±2)h。

(4)可疑阪崎肠杆菌菌落的鉴定

挑取可疑阪崎肠杆菌菌落5个以上(不足5个的全挑)于1mL无菌生理盐水中，搅散混匀稀后取1环在TSA平板划线分离，于(25±1)℃培养(48±4)h。TSA平板上可疑阪崎肠杆菌菌落呈黄色，挑取溶解进行生化鉴定。

3结果与分析

3.1沙门氏菌和阪崎肠杆菌阳性对照定性试验

首先开展了空白添加鼠伤寒沙门氏菌和阪崎肠杆菌交互试验，通过增菌、选择性增菌和平板分离，观察了沙门氏菌和阪崎肠杆菌在选择性平板上的菌落特征(见表１)。以观察在2种菌混杂感染情况下的增菌和平板分离及菌落特点。采用TTB和SC2种选择性增菌液，TTB对沙门氏菌的选择性强，SC对沙门氏菌的适应性广。表1表明，阪崎肠杆菌能够在沙门氏菌SC和TTB2种选择性增菌液中存活；沙门氏菌能够在阪崎肠杆菌选择性增菌液mLST-Vm中存活；阪崎肠杆菌在沙门氏菌显色平板上呈蓝绿色菌落，虽然可以和典型沙门氏菌区别，但容易和非典型(如肠炎沙门氏菌)混淆；阪崎肠杆菌在XLD平板上呈黄色菌落，且周围培养基变黄。由此可见，这2种平板对沙门氏菌和阪崎肠杆菌2个菌属的分离特异性不高； 该实验中所用各增菌液和分离平板质量可靠。

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