一株安徽本地泡菜中产细菌素乳酸菌的筛选与鉴定（一）

乳酸菌是一类可发酵利用碳水化合物并产乳酸的革兰氏阳性菌的总称。具有调节肠道内菌群结构、改善肠道微环境，降低血清胆固醇等生理功能。乳酸菌还作为一种重要的工业微生物，广泛应用于制作酱油、熏肉、泡菜等食品发酵行业。

目前医疗上抗生素的滥用带来了严重危害，大量耐药突变菌株的出现让人们束手无策，亟需发现一类新型绿色抗菌物质来代替抗生素，细菌素被认为是目前最佳的抗生素替代品。细菌素是由乳酸菌产生的具有抑菌活性的肽类或蛋白类物质，广泛存在于乳酸菌代谢产物中。作为一种蛋白类物质，细菌素可被蛋白酶水解而不会残留于人或动物体内，不易产生耐药性，因此具有较高的安全性。细菌素还可抑制片球菌、李斯特菌、梭菌、金黄色葡萄球菌等腐败菌的生长，被公认为食品保藏技术中最具有开发和应用前景的物质。

近年来，产细菌素乳酸菌的筛选与鉴定在各地多种泡菜研究中多有报道。但在安徽本地泡菜中却未见报道。本文从安徽本地泡菜中筛选对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用的乳酸菌菌株，得到菌株L.plantarumPC-3，对其进行生理生化和分子生物学实验鉴定，并确定其所产主要抑菌物质的性质，为开发食品运输和贮藏过程中控制有害菌的拮抗制剂出发菌株和具有新型生物防腐剂功能的细菌素产生菌提供了理论依据。

一、材料与方法

1、材料与试剂

泡菜：安徽家庭自制，取自安徽本地新鲜芥菜2500g，洗净，自然晾干，放入洗净晾干的广口泡菜坛底部，加入500g食盐，涂抹均匀，再向泡菜坛中加入清水至坛口处，注意不要漫过坛口，盖上坛盖，在坛口边沿处加入少许清水密封。置阴凉干燥处，三个月后即可食用。指示菌株：大肠杆菌(ATCC8099)，金黄色葡萄球菌(ATCC6538)，购自安徽艾浮地艾空气净化检测站，来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

MRS琼脂培养基、MRS液体培养基、LB液体培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；明胶液化培养基、硝酸盐还原实验培养基：广东环凯微生物科技有限公司；精氨酸产氨实验对照生化管、SIM培养基、糖发酵生化管：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；琼脂粉：索莱宝生物科技有限公司；过氧化氢酶(2500U／mg)、胰蛋白酶(250U／mg)、胃蛋白酶(3000U／mg)：上海蓝季生物科技有限公司；蛋白酶K(33.5U／mg)：德国默克MERCK；细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DL2000DNAMarker：天根生化科技有限公司；化学试剂均为分析纯。

2、仪器与设备

梯度PCR仪：美国ABI公司，核酸电泳仪：北京市六一仪器厂；AlphaImagerHP荧光／可见光凝胶成像分析系统：美国Alpha公司；S201-KpH计：梅特勒公司；SW-CJ-lF单人双面净化工作台：苏州净化设备厂；生物显微镜：上海一恒科技有限公司；SHP-100生化培养箱：扬州市三发电子有限公司；LS-B50L电加热式蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备厂；GL-16G-11高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂。

3、方法

（1）乳酸菌的分离

无菌条件下将泡菜与汁液混合均匀，取1mL汁液加至9mL灭菌生理盐水中，制成1:10的样品匀液，充分振荡后按上述操作顺序，做10倍递增稀释样品匀液，选择2～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别涂布于含1％CaC03的MRS固体培养基上，37℃厌氧培养48h；挑取有溶钙圈的白色单菌落，在MRS固体平板上划线筛选，选取单一菌落，进一步划线分离纯化，挑取单一菌落接种至MRS斜面上，做好标记，4℃保存备用。

(2)抑菌实验

①乳酸菌无细胞发酵上清液(cell-freefermentationsupematant，CFS)的制备2％接种量接种生长至对数期的菌液于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养48h，4℃、8000r／min离心10min，收集发酵上清液，0.45μL滤膜过滤，4℃保存备用。

②牛津杯法抑菌实验

采用双层琼脂扩散法，将10mL灭菌素琼脂固体培养基倒入无菌培养皿中，待完全凝固后作为底层培养基，每皿按正方形四角位置轻放入4个无菌牛津杯，将0.1mL浓度为l×108CFU／mL的指示菌液加至10mL冷却至45～50℃的LB固体培养基中，小心混匀后倒至底层培养基上，注意不要加到牛津杯内，待其完全凝固，作为菌层培养基。小心取出牛津杯，注意不要破坏已形成的孔洞，向直径约为8mm孔洞内加入待检CFS，37℃厌氧培养18h后，测量抑菌圈直径。采用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，同时用生理盐水作为对照。挑选抑菌圈最大的乳酸菌菌株作后续研究。

③乳酸菌的产酸曲线与生长曲线的测定

采用双层琼脂扩散法，将10mL灭菌素琼脂固体培养基倒入无菌培养皿中，待完全凝固后作为底层培养基，每皿按正方形四角位置轻放入4个无菌牛津杯，将0.1mL浓度为l×108CFU／mL的指示菌液加至10mL冷却至45～50℃的LB固体培养基中，小心混匀后倒至底层培养基上，注意不要加到牛津杯内，待其完全凝固，作为菌层培养基。小心取出牛津杯，注意不要破坏已形成的孔洞，向直径约为8mm孔洞内加入待检CFS，37℃厌氧培养18h后，测量抑菌圈直径。采用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，同时用生理盐水作为对照。挑选抑菌圈最大的乳酸菌菌株作后续研究。抑菌实验中抑菌圈直径最大的乳酸菌单菌落，接入MRS液体培养基中，37℃厌氧培养48h，以2％接种量将种子液接人MRS液体培养基中进行增殖培养，分别在0、2、4、6，8，10，12、14716，18720，22，24，26，28、30、32、34、36、38、40、42、44、48h时取样，于波长600am处测定OD600和培养基的pH，以培养时间为横坐标，以pH和OD600值为纵坐标，绘制培养时间一光密度、pH标准曲线。

（4）有机酸、过氧化氢抑菌作用排除实验

采用双层琼脂扩散法，将10mL灭菌素琼脂固体培养基倒入无菌培养皿中，待完全凝固后作为底层培养基，每皿按正方形四角位置轻放入4个无菌牛津杯，将0.1mL浓度为l×108CFU／mL的指示菌液加至10mL冷却至45～50℃的LB固体培养基中，小心混匀后倒至底层培养基上，注意不要加到牛津杯内，待其完全凝固，作为菌层培养基。小心取出牛津杯，注意不要破坏已形成的孔洞，向直径约为8mm孔洞内加入待检CFS，37℃厌氧培养18h后，测量抑菌圈直径。采用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，同时用生理盐水作为对照。挑选抑菌圈最大的乳酸菌菌株作后续研究。抑菌实验中抑菌圈最大的乳酸菌菌株CFS，将CFS的pH中和至5.0后，按采用双层琼脂扩散法，将10mL灭菌素琼脂固体培养基倒入无菌培养皿中，待完全凝固后作为底层培养基，每皿按正方形四角位置轻放入4个无菌牛津杯，将0.1mL浓度为l×108CFU／mL的指示菌液加至10mL冷却至45～50℃的LB固体培养基中，小心混匀后倒至底层培养基上，注意不要加到牛津杯内，待其完全凝固，作为菌层培养基。小心取出牛津杯，注意不要破坏已形成的孔洞，向直径约为8mm孔洞内加入待检CFS，37℃厌氧培养18h后，测量抑菌圈直径。采用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，同时用生理盐水作为对照。挑选抑菌圈最大的乳酸菌菌株作后续研究步骤做抑菌实验，并设pH=5.0的乙酸、乳酸和原始未调pH的CFS为对照，重复3次，测量抑菌圈直径。取过氧化氢酶溶液0.1mL，加至0.9mLpH=5.0的CFS中，使过氧化氢酶终浓度为50U／mL，并设未加过氧化氢酶的pH=5.0CFS和原始未调pH的CFS为对照，重复3次，牛津杯法测量其抑菌圈直径。验证乳酸菌CFS的主要抑菌活性物质是否为有机酸和过氧化氢。

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