一株安徽本地泡菜中产细菌素乳酸菌的筛选与鉴定（二）

（5）抑菌物质的蛋白酶水解作用实验

采用双层琼脂扩散法，将10mL灭菌素琼脂固体培养基倒入无菌培养皿中，待完全凝固后作为底层培养基，每皿按正方形四角位置轻放入4个无菌牛津杯，将0.1mL浓度为l×10⁸CFU／mL的指示菌液加至10mL冷却至45～50℃的LB固体培养基中，小心混匀后倒至底层培养基上，注意不要加到牛津杯内，待其完全凝固，作为菌层培养基。小心取出牛津杯，注意不要破坏已形成的孔洞，向直径约为8mm孔洞内加入待检CFS，37℃厌氧培养18h后，测量抑菌圈直径。采用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，同时用生理盐水作为对照。挑选抑菌圈最大的乳酸菌菌株作后续研究抑菌实验中抑菌圈最大的乳酸菌菌株CFS，分别调节pn为蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶的最适作用pH，按1.0mg／mL分别加入蛋白酶K(最适pH7.0)、胃蛋白酶(最适pH2.0)、胰蛋白酶(最适pH7.0)，37℃下温育1h，将CFS的pH调回到5.0，牛津杯法测量其抑菌圈直径，重复3次，以未经蛋白酶处理过的pH=5.0的CFS为对照。验证乳酸菌CFS的抑菌活性物质是否为蛋白类。

（6）乳酸菌形态学特征观察

采用双层琼脂扩散法，将10mL灭菌素琼脂固体培养基倒入无菌培养皿中，待完全凝固后作为底层培养基，每皿按正方形四角位置轻放入4个无菌牛津杯，将0.1mL浓度为l×10⁸CFU／mL的指示菌液加至10mL冷却至45～50℃的LB固体培养基中，小心混匀后倒至底层培养基上，注意不要加到牛津杯内，待其完全凝固，作为菌层培养基。小心取出牛津杯，注意不要破坏已形成的孔洞，向直径约为8mm孔洞内加入待检CFS，37℃厌氧培养18h后，测量抑菌圈直径。采用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，同时用生理盐水作为对照。抑菌实验中抑菌圈最大的乳酸菌菌株接种于MRS固体平板上四区划线，37℃厌氧培养48h，观察固体平板上的菌落形态特征并挑取单菌落进行革兰氏染色实验，镜检观察菌体染色结果和形态学特征。

（7）菌种鉴定

①生理生化鉴定实验

参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中的实验方法，采用双层琼脂扩散法，将10mL灭菌素琼脂固体培养基倒入无菌培养皿中，待完全凝固后作为底层培养基，每皿按正方形四角位置轻放入4个无菌牛津杯，将0.1mL浓度为l×10⁸CFU／mL的指示菌液加至10mL冷却至45～50℃的LB固体培养基中，小心混匀后倒至底层培养基上，注意不要加到牛津杯内，待其完全凝固，作为菌层培养基。小心取出牛津杯，注意不要破坏已形成的孔洞，向直径约为8mm孔洞内加入待检CFS，37℃厌氧培养18h后，测量抑菌圈直径。采用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，同时用生理盐水作为对照。抑菌实验中抑菌圈最大的乳酸菌菌株进行生理生化鉴定。

②16SrRNA基因保守序列扩增

采用双层琼脂扩散法，将10mL灭菌素琼脂固体培养基倒入无菌培养皿中，待完全凝固后作为底层培养基，每皿按正方形四角位置轻放入4个无菌牛津杯，将0.1mL浓度为l×10⁸CFU／mL的指示菌液加至10mL冷却至45～50℃的LB固体培养基中，小心混匀后倒至底层培养基上，注意不要加到牛津杯内，待其完全凝固，作为菌层培养基。小心取出牛津杯，注意不要破坏已形成的孔洞，向直径约为8mm孔洞内加入待检CFS，37℃厌氧培养18h后，测量抑菌圈直径。采用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，同时用生理盐水作为对照。

将抑菌实验中抑菌圈最大的乳酸菌菌株进行细菌基因组的提取，按照已购细菌DNA提取试剂盒说明书实验操作步骤进行。

③菌种鉴定并构建系统进化树

取5μL扩增片段100V电压下，1％琼脂糖电泳观察结果(大小应为1500bp左右)。验证后的电泳条带胶回收试剂盒回收，回收产物送上海生工生物工程有限公司测序。将菌株16SrRNA基因测序结果与GenBank数据库中已知菌株保守序列进行比对，通过MEGAX软件分析目的基因序列的同源性，并构建系统发育树。

4、数据处理

每个实验3个平行，数据用x^-±s表示。

二、结果与分析

1、乳酸菌菌株分离

从安徽本地泡菜中共分离获得10个溶钙圈的白色单菌落，经初步鉴定获得6株乳酸菌，进一步筛选纯化后按照菌株来源和挑取顺序命名。

2、抑菌实验结果

抑菌实验结果如图1所示，菌株PC-3对2种指示菌抑菌圈直径最大，抑菌效果最好，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别达到17.17+0.42mm和19.23±0.61mm。结果表明该菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用。原因可能是乳酸菌在生长代谢的过程中产生了有机酸、H₂0₂或细菌素，从而抑制了指示细菌的生长。选择PC-3号菌株作为后续实验菌株。

3、菌株PC-3生长曲线和产酸曲线的测定

菌株PC-3生长曲线和产酸曲线如图2所示，该菌株在0～12h处于延滞期，生长缓慢，延滞期相对较长。菌株PC-3在12h后进入对数期，菌细胞迅速繁殖生长，在36h菌细胞数达到最大值。在菌体进入对数生长期后菌液的pH迅速降低，稳定期时pH维持在4.0左右。
 

4、有机酸和过氧化氢排除抑菌实验结果

菌株PC-3CFS对两种指示菌的抑制作用，可能是菌株PC-3代谢合成的细菌素或酸性末端产物如有机酸或过氧化氢作用的结果。如图3所示，pH=5.0的菌株Pc-3CFS与原始CFS抑菌效果相比，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别下降了7.0％和6.6％，说明pH=5.0的菌株Pc-3CFS与原始CFS抑菌效果相近，后续试验中抑菌效果对比可以pH=5.0作为pH调节基准；pH=5.0的乳酸和乙酸对照组对两种指示菌的抑菌圈直径明显减小，抑菌效果明显减弱，说明排除乳酸和乙酸的干扰后，CFS中还存在其他抑菌物质，菌株PC-3CFS中起主要抑菌作用的物质并非有机酸类。

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