滚环扩增技术在食品安全检测中的研究进展（二）

2RCA技术在食品安全检测中的应用

把靶标物数量的信号转换成核酸模式信号，再用RCA将核酸信号放大并转化为检测信号，从而达到构建RCA生物传感器的目的。本文分别围绕食品中食源性致病微生物、生物毒素、重金属和农兽药残留等危害因子的筛选或定量分析工作，重点概述近几年RCA技术在食品安全检测的应用发展。

2.1食源性致病微生物

食源性致病微生物，主要是大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌等，极易污染引起食源性疾病，是世界范围内严重的食品安全问题之一。RCA用于微生物的定量检测，可通过定量微生物的特定标志性核酸的方式进行。例如，WANG等和ZHANG等先后建立了基于跨越式滚环扩增(SRCA)的蔬菜沙拉中志贺氏菌、婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌检测平台，当以荧光信号检测时，SRCA方法比PCR方法灵敏度提高100倍以上。ZHAN等先利用不对称PCR(asPCR)扩增单核细胞增多性李斯特菌的标志性核酸序列，再将asPCR扩增产物作为RCA扩增的引物，实现了核酸信号的双步放大，该方法在莴苣匀浆中实现了检出限(limitofdetection，LOD)为4.0×102CFU/g的灵敏检测。为避免核酸的提取纯化过程而更利于现场检验的开展，越来越多的研究团队使用核酸适配体特异性识别食源性致病微生物。GUO等使用抗体-细胞-核酸适配体夹心结构，首次将RCA扩增DNA模拟酶引入到食源性致病微生物的电化学检测中。此方法对大肠杆菌表现出超高灵敏度与特异性，LOD达到8CFU/mL。XU等[31]首次在核酸适配体传感器中采用双步放大策略，建立了一种检测金黄色葡萄球菌的NEAR-RCA机制，可检测到低至5CFU/mL的金黄色葡萄球菌。

RCA结合纳米材料技术，可得到优异的检测效果。GAO等利用副溶血性弧菌在载体上触发RCA，RCA产物富集游离的Au@Ag探针以增强载体表面拉曼散射信号，建立了LOD低至1CFU/mL的微生物检测方法。芯片化、高通量化是快检技术发展的方向之一，RCA在微流控芯片上也发挥了显著作用。JIANG等开发出一种针对大肠杆菌O157：H7的RCA放大微流控芯片，与未进行RCA的对照组相比，其信号强度提高了50倍以上。ZHAN等建立的基于RCA信号放大的间接竞争性酶联适配体法对莴苣样品中的单核细胞增多性李斯特菌也取得了良好的检测结果。

食源性致病微生物是RCA在食品安全应用的热点，利用微生物特征核酸构建检测具有较好的特异性，但增加了前处理过程，而通过抗体、核酸适配体识别微生物更利于现场检测的展开。RCA方法构建灵活，与新型纳米材料、微流控等多学科技术的结合使用助力RCA技术体系的不断完善，其在食源性致病微生物检测中的应用前景也将会更加广阔。

2.2生物毒素

目前，基于RCA的生物毒素污染检测多集中于谷粮中的霉菌毒素。以粮食在贮藏过程中由赭曲霉产生的强毒性真菌毒素污染物赭曲霉毒素A(ochratoxinA，OTA)[34]为例，来自福州大学的Lin课题组基于RCA技术，在2015年开发出了竞争性荧光核酸适配体传感器和电化学发光适配体传感器；2018年，该课题组将HRCA发生在电加热氧化铟锡电极上，开发出用于检测OTA的原位温度控制电化学发光传感器，其LOD低至8fg/mL。结合纳米技术可降低样品基质的影响，ZHANG等基于纳米金和磁性纳米粒子的生物条形码技术，建立了对燕麦、小米、面粉等食品中T-2毒素的RCA检测系统，其LOD低至0.26pg/mL。在动物性食品中毒素检测中，PANG等利用RCA扩增出大量G-四联体/heminDNA模拟酶并对乳样中的黄曲霉毒素M1(alfatoxinM1，AFM1)进行了灵敏测定，其LOD为0.15ng/mL。为了检测蛤蜊肉中的大田软海绵酸毒素(okadaicacid，OA)，GU等[9]依靠RCA设计了一种灵敏的直接性竞争核酸适配体荧光分析方法，该方法在1pg/mL～100ng/mL的线性范围上，LOD达到了1pg/mL。

核酸适配体是食品安全快速检测常用的靶标识别元件，相对于蛋白质抗体，核酸适配体能直接介导RCA反应的进行。然而相较于AFM1、OTA等真菌毒素，动物毒素、植物毒素的核酸适配体的文献少有报道。因此，RCA技术在生物毒素检测中的应用主要集中于微生物毒素之中，其中又以真菌毒素为主。随着越来越多种类生物毒素核酸适配体或抗体的筛选，RCA技术在生物毒素检测中将有更广泛的应用。

2.3农、兽药残留

近几年食用农产品中农、兽药残留的快速检测方法的发展市场需求量急剧上升，然而却多受基质的影响导致方法检测效果不稳定。因此，RCA信号放大技术的应用，对于提高农兽药残留检测性能起到积极的作用。LIU等将乙酰胆碱酯酶催化介导的DNA构象变化与RCA的信号放大结合起来，提出了一种均相电化学分析平台，用于果蔬中有机磷农药和氨基甲酸酯类农药的灵敏检测。该平台对乐果在10～10000μg/L的线性范围中的LOD低至2.1μg/L。HE等以牛奶和鱼肉中卡那霉素为模型分析物，开发了一种用于食品中抗生素检测的纳米金改性搅拌子辅助吸附提取-RCA信号放大微流控芯片，通过比例策略与搅拌棒提取相结合显着降低基质干扰，具有极好的灵敏度，其检出限低至0.3pg/mL。本课题组首次在RCA扩增产物上杂交时间分辨荧光探针，开发了一种食品中氧氟沙星灵敏的竞争性检测方法。该方法使用磁性纳米粒子实现复杂食品基质中靶标成分快速分离富集，结合时间分辨荧光探针进一步消除基质荧光对信号的影响，LOD低至32.1pmol/L。食品的复杂基质是影响食品快检检测性能的重要因素，上述研究通过多种途径降低了基质的干扰，达到了对农兽药理想的检测效果，可为复杂样品中小分子有毒有害物质的检测提供参考。

2.4重金属

重金属是持续存在的环境污染物，严重威胁公共卫生和食品安全，建立高灵敏的检测方法，对以铅、汞为主的重金属污染检测具有重要的现实意义。目前基于RCA的重金属检测研究以水样为主，水是食品的重要原料，因此对水中重金属含量的监控是减少食品中重金属污染的重要途径。表1例举了部分近年来RCA在铅、汞检测中的应用报道，与非RCA的快速检测法相比，基于RCA的检测技术更保证了方法的灵敏度。Hg²⁺生物传感器以胸腺嘧啶12聚体[thymine12-mer，(T)12]探针为识别元件，这是由于特殊的T-Hg²⁺-T配位化学系统对Hg²⁺具有高选择性和亲和力；而在Pb²⁺的检测中应用广泛的是依赖Pb²⁺的DNA模拟酶，此类核酸模拟酶在Pb²⁺存在的情况下对底物链有特异性识别和切割活性，并且切割效率与Pb2+浓度密切相关，可将Pb²⁺浓度转化为可测量的核酸信号。基于以上原理，CAI等巧妙地设计了一种利用双DNA模拟酶反馈扩增(dual-DNAzymefeedbackamplification，DDFA)-双重RCA信号放大的电化学Pb²⁺检测系统。此系统对水中Pb²⁺表现出高选择性和检测灵敏度，LOD为0.048pmol/L且样品用量减少到10µL。

2.5其他食品安全危害因子检测

基于RCA生物传感器检测食品中非法添加剂、转基因农作物以及食物掺伪等食品安全危害物的分析方法也有所报道。例如，WANG等开发的多重不对称PCR与不对称HRCA联用的反向点杂交系统来检测转基因农作物，对转基因大豆DNA检出限低至0.5ng/L，并表明RCA技术应用于转基因农作物的多重靶基因测定可提高检测速度、降低检测成本。XU等构建了新的乳制品中三聚氰胺掺假检测方法：利用三聚氰胺可以与2个胸腺嘧啶配合形成稳定的T-三聚氰胺-T结构的特性，开发出的T-三聚氰胺-T碱基错配介导的RCA信号增强荧光方法对牛奶中的三聚氰胺检出限达2.5nmol/L，证明了RCA在食品掺伪监控中的应用潜力。HE等建立了以菌类中α-amanitin基因为检测靶标的检测方法，作为筛选食品中致死性amanitas菌类的工具。该方法在烘干后的多种蘑菇混合物中可检测到低至0.2%的致死性amanitas菌类组分，为RCA在有毒菌类与食用菌类鉴别中的应用提供了参考。对于包装中化学物质在食品中的迁入，LI等构建了基于RCA-ExoIII的信号循环放大荧光分析法，该方法对瓶装水中迁入的有害物质双酚A显示出优秀的灵敏度，LOD为5.4×10‒17mol/L。

3总结与展望

本文集中介绍了RCA技术在食品安全中的应用，重点概述了近几年其在食源性致病微生物、生物毒素、农药兽药残留、重金属中的应用进展。在这些危害因子中，食源性致病微生物的检测是RCA技术在食品安全中应用的热点；而RCA对食品中转基因组分、过敏源的研究报道较少，但RCA在对微核酸、蛋白质等疾病标志物的检测应用可为其提供相应的参考；RCA在生物毒素检测中的应用以粮食中的真菌毒素为主，农药兽药残留和重金属多为小分子，多基于功能核酸的识别，并且为减小复杂基质的影响，RCA技术应用于此类的检测结合分离富集或者其他信号放大技术，降低背景信号，提高信噪比。虽然众多的研究论文已经证明了利用RCA技术开发检测方法的优势，并且一些设备/分析已经商业化，但它们的广泛应用尚未得到充分实现。

RCA的应用和产品化仍需要注意解决几个方面的实际问题。(1)假阳性问题：非特异性成环是RCA出现假阳性的重要原因，解决方案包括进行阴性对照、使用核酸外切酶对未结合探针降解以及设计更具特异性的引物或模板。(2)食品复杂基质的影响：样品复杂成分对酶促反应、以及核酸的稳定有较大影响，并且易造成纳米颗粒的聚集。这时可以引入稳定的分离、放大技术或者进行严格的样品前处理步骤。然而同一检测体系中多种技术的使用，检测成本难免提高。(3)仪器的制约：缺少紧凑、重量轻、体积小的非实验室环境使用的核酸等温扩增仪器来辅助RCA反应的进行或信号的检测。国外如英国Optigene公司的Genie®系列可用于RCA的荧光信号的检测，但价格昂贵。因此，基于RCA的便携式、简单快速、灵敏稳定的生物分析系统的实现，不仅是一个分子生物学问题，也是一个复杂的多学科的甚至工程学的问题。然而，RCA技术在提升生物传感器检测性能上有着固有的优势，我们相信通过其机理研究的深入和与其他技术交叉互补，该技术将得到进一步发展和完善，在食品安全检测方面将会有更大的应用潜力。

声明：本文所用图片、文字来源《食品安全质量检测学报》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系删除

相关链接：重金属，生物，毒素