单核增生李斯特氏菌近红外快检方法建立与应用（一）

目的 建立一种近红外荧光免疫法快速检测单增李斯特氏菌的方法。方法 采用近红外荧光染料Dylight800标记单增李斯特菌单克隆抗体，结合免疫侧向流技术制备单增李斯特菌快速检测试纸条。结果 整个实验过程仅需45 min，对食品中单增李斯特氏菌最低检测限为500 CFU/mL，与其他5种食源性致病菌均无交叉反应。特异性为89.47%，敏感性为100%。采用近红外荧光免疫层析法和传统方法对30份食品进行检测，结果发现2种方法符合性达93.3%。结论 所研制的单增李斯特菌的近红外快检试纸条具有特异性、敏感性较高的特点，适用于食品样本中单增李斯特菌的即时检测。

引言

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytocyto genes，LM)简称单增李斯特菌，是一种革兰氏阳性细菌，是人类感染李斯特菌病的病原体。该细菌即使在低温和酸性环境中也能够生存。研究发现在冷藏食品中，单核细胞增生李斯特氏菌是一种严重的食源性病原体。单核细胞增生李斯特氏菌广泛存在于自然界中，该菌的大流行都与食物污染有关，尤其是预包装即食食品被感染，WHO已将它列为重点监测对象。2015年，欧盟共报告了2206例李斯特菌病病例，即每10万人李斯特菌病发病率为0.46[4]，由此可见李斯特菌病的发病率较低，但死亡率为20%～30%。目前李斯特氏菌感染健康成人的病例比较少见，但老年人、孕妇或免疫功能低下患者感染单增李斯特菌的风险较高，李斯特菌病与败血症等相关的侵袭性疾病例如脑炎和脑膜炎有关。目前研究发现即食食品较易被单增李斯特氏菌感染，现场急需对即食食品进行批量快速检测。

单增李斯特菌传统检测法虽然准确，但耗时长需要5～6 d、人力物力花费大，不适于快速检测。食品中LM传统的检测方法是将分离培养后的可疑菌落进行生化反应、典型运动性观察、动物实验等，确定为李斯特杆菌后再进一步做血清型分析，这其中增菌或选择性增菌是必需的一个环节。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，创建了很多快速、简便、特异的检测方法如胶体金免疫层析。目前一些研究将纳米金颗粒-抗体结合免疫层析技术检测霍乱弧菌、沙门氏菌等致病菌。但该标记技术灵敏度较低、无法精确定量，急需新型免疫层析技术进行快速检测。

近红外荧光免疫测定具有背景干扰小，组织穿透力强等特点，近年来备受关注。2008年，AMIOT等研究表明金属纳米结构与近红外荧光材料结合使用可提高荧光强度，对痕量目标进行灵敏测定。2013年SWANSON等将近红外荧光染料与选定的抗体偶联并整合到免疫层析试纸条中，可单重及多重同步检测白细胞介素-6和C-反应蛋白。综上，以近红外荧光探针的检测方法在医学生物造影领域、环境污染分析、食品安全检测等方面得到广泛应用，引进和消化这些先进的方法是检测领域的当务之急。免疫侧向流技术是一种基于试纸条的生物传感器装置，在医疗诊断标准分子检测、食品安全检测、环境污染物分析等方面都有应用。但目前应用于单增李斯特氏菌检测的研究较少。

本研究采用近红外荧光免疫层析技术，研发了一种基于低噪声荧光标记的单增李斯特氏菌免疫层析试纸条，解决了如何快速定量检测食品中的单增李斯特菌的问题，可用于进出口食品中单增李斯特氏菌的即时检测，为口岸监管提供一种可靠的快检技术。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株ATCC15313-1(北京海关技术中心实验室保存)。

单增李斯特菌单抗、多抗(美国pierce公司)；荧光染料dylight800(美国Thermofisher公司)；羊抗鼠免疫球蛋白Ig G(北京天坛生物制品有限公司)；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂、李氏增菌肉汤(lysogeny broth，LB1，LB2)、李斯特菌显色培养基(青岛海博生物公司)。

食品为日常抽检样品。

1.2 仪器与设备

smartreader101便携式高灵敏度近红外荧光扫描仪(北京博润福得科技有限公司)；Tuttnauer高压灭菌器(上海斯高勒生物科技有限公司)；5702R高速低温离心机(德国艾本德公司)；MIR-162恒温培养箱(日本SANYOO公司)；Barnstead Pacific RO超纯水仪(美国Thermo公司)；XC-CD2500型超声破碎仪(宁波市先倡电子科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 制备单增李斯特标准菌株菌悬液

取浓度为1×105 CFU/m L的单增李斯特标准菌株，用含5%牛血清蛋白(bull serum albumin，BSA)，0.1%Tween20，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)稀释。分别制成不同浓度的菌悬液。

1.3.2 近红外荧光染料标记单增李斯特氏菌单克隆抗体和鼠Ig G

用PBS(p H 7.4)缓冲液将Dylight800稀释10倍，单增李斯特菌单抗与Dylight 800稀释液按2：1质量比混匀，需避光2 h以上。挑选合适的透析袋(含PBS缓冲液)，将标记好的终产物放入内，4℃透析4 h。将终浓度为1.5%BSA、0.15%Tween20和0.15‰叠氮化钠加入标记好的标记产物中，4℃保存(备用)。

1.3.3 近红外免疫层析试纸条的组装

试纸条组装(图1)由样品垫、结合垫、吸水垫及抗体承载膜等组成。将层析缓冲液稀释后的标记产物喷于结合垫上，室温风干；样品垫：含5%BSA、0.1%Tween 20 PBS缓冲液喷涂制备，室温风干；检测线：单增李斯特氏菌多抗，质控线：羊抗鼠Ig G多抗，室温风干制备；将制备好的样品垫、结合垫、抗体承载膜和吸水垫沿底板的长度方向上依次粘附，然后切割成试纸条即可。

1.3.4 定性检测

取单核细胞增生李斯特氏菌稀释液浓度为0.5×103 CFU/m L，将1 m L菌悬液加入7 m L PBS缓冲液中，采用超声破碎仪，破菌后间隔15 s工作，40%能量，30个循环。

经超声处理后，吸取100µL滴入样品垫上，再滴入层析液50µL。室温反应15 min后，采用近红外荧光扫描仪测定。测定质控线区域、检测线区域的荧光强度，根据结果判断试纸条是否有效；是否是阳性结果。

1.3.5 制备单增李斯特菌标准曲线

取1.3.1制备的单核细胞增生李斯特氏菌菌悬液0.5×105、1×105、0.5×104、1×104、0.5×103、1×103 CFU/m L。吸取1 m L菌悬液加入7 m L PBS缓冲液中，步骤同1.3.4。室温静置15 min，将制备好的免疫层析试纸条放入近红外荧光扫描仪中测定。将不同浓度的菌悬液加入试纸条待检，扫描读取检测线区域、质控线区域的荧光值。每个浓度标准品平行测量两次，取平均值作为测量值，以其相对应的样品浓度作标准工作曲线。

1.3.6 传统方法检测

根据文献GB 4789.30—2016《食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌》将菌株进行活化，过夜培养，以PBS将菌液梯度稀释，浓度分别为1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104、1.5×103、1.5×102 CFU/m L。标准菌株未增菌直接划线李斯特菌显色培养基，于(36±1)℃培养24～48 h，观察各个平板上菌落生长情况。

1.3.7 特异性和敏感性试验、稳定性实验

制备副溶血弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌五种食源性致病菌菌悬液，浓度均为0.6×104 CFU/m L。破菌处理，同1.3.4步骤，室温放置15 min后，采用近红外荧光扫描仪检测。稳定性实验：所研制的试纸条在4℃下放置20 d后，在室温下采用近红外荧光扫描仪进行稳定性检测。

1.3.8 近红外免疫层析试纸条样本检测

根据文献GB 4789.30—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》和近红外荧光免疫层析法分别检测来自北京海关技术中心实验室的30份食品样品，并将检测结果进行比较。公式参考文献特异性=真阴性/(真阴性+假阳性)×100%；灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%

以上各实验均在室温干燥环境下进行操作(实验环境的温度20℃±5℃，湿度50%±10%)。

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