现代生物技术在动物源性食品抗生素残留检测中的应用进展（二）

1.3 荧光免疫分析法

荧光免疫分析法（Fluorescence Immunoassay,FIA）是用荧光素标记抗体进行抗原抗体反应，以抗体的特异性反应加上荧光物质的示踪，来达到被测抗原物质在组织或细胞内的定性和定位。常用异硫氰基荧光素（FITC）为标记物，当标记抗体与抗原特异性结合后，在抗原的定位处可显示出荧光，在荧光显微镜下呈现明亮的特异性荧光。此法可检出原先在一般的组织切片或涂片中难以察见的某些特殊成分或抗原，由免疫学技术加上示踪技术并结合形态学的检查，使特异性的检测、鉴定和抗原定位一次完成。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（Aluorescent Antibody Technique）。其基本方法有直接法、间接法、补体结合法和双标记法四种。

Sheng Wei等开发了一种荧光免疫测定法（FIA），以Zn Cd Se/Zn S量子点（QD）充当荧光标记，金纳米颗粒（Au NPs）充当淬灭剂。该测定以“开启”模式进行，即荧光信号（在302/525nm激发/发射波长下最佳测量）随分析物浓度的增加而增加。该测定法可以同时检测四环素抗生素，包括四环素、土霉素、金霉素和强力霉素，且不受其他兽药的干扰。四环素类抗生素的视觉检测极限（LOD）为缓冲液中2μg/L，牛奶中20μg/L和动物肌肉组织中40μg/L。测定（包括样品处理）可以在30min内进行。基于“打开”模式的FIA比使用Au NPs或QD作为信号标记的胶体金基免疫色谱分析（CGICA）和基于“关断”模式的量子点免疫色谱分析（QDICA）更为灵敏。一个条带可以基于在紫外光下的QD发光猝灭同时以“打开”模式提供荧光测试结果。比色测试属于“关闭”模式，该模式基于在自然光下使用Au NPs而形成红色。使用这种双功能测试模式可以快速半定量测定牛奶和组织样品中的四环素抗生素。

Song Erqun等结合了基于多色量子点（QD）的免疫荧光测定法和阵列分析方法，以实现牛奶中链霉素（SM）、四环素（TC）和青霉素G(PC-G）的同时，灵敏和可视化检测。将SM,TC和PC-G的抗体（Ab）与具有不同发射波长（QP(520nm）、QD(565nm）和QD(610nm））的QD偶联，以用作检测探针（QD-Ab）。然后，基于QD-Ab探针的荧光，在抗原包被的微量滴定板孔中进行直接竞争性荧光免疫测定，以同时定性和定量检测SM、TC和PC-G残留。SM、TC和PC-G的线性范围分别为0.01～25ng/m L、0.01～25ng/m L和0.01～10ng/m L，每种的检测极限均为5pg/m L。根据QD-Ab探针的荧光，目测并同时确定了三种抗生素的残留量。与商业化酶联免疫吸附测定试剂盒相比，此法可以在一次运行中同时分析多个样品中的多种目标抗生素（高通量分析），并提高了分析纯正牛奶中三种抗生素残留的准确性和灵敏度，预期此法可以在减轻残留抗生素对人类健康和生态系统的负面影响方面发挥重要作用。

1.4 胶体金免疫分析法

胶体金免疫分析法(Gold Colloid Immunoassay,GIA）是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种免疫标记技术。其主要原理是利用在可见光波长范围内有较强吸收效应的金纳米颗粒来标记抗原或抗体进行免疫检测。与金标抗原或抗体结合的待测分子将被金颗粒“染色”。该技术主要包括胶体金免疫组织化学技术和胶体金免疫测定技术两种类型。1971年由Faulk与Taylor首先将胶体金免疫技术应用于免疫电镜技术，目前不仅应用于免疫电镜和光镜定位检测，而且在抗原或抗体检测、兔疫转印技术流式细胞术及芯片技术等检测中也有广泛应用，具有简便、快速、安全等特点。

Shi Qiaoqiao等建立了以胶体金（Au NPs）与抗新霉素的单克隆抗体（NEO-m Ab）和拉曼探针分子4-氨基硫酚（PATP）偶联制备的免疫探针测定新霉素（NEO）的方法。该方法的半数抑制浓度（IC50）和检测下限（LOD）分别为0.04ng/m L和0.216pg/m L。该测定法与其他化合物没有交叉反应性，表明该测定法具有很高的特异性。添加了NEO的牛奶样品的回收率在89.7%～105.6%的范围内，相对标准偏差（RSD）为2.4%～53%(n=3）。结果表明，该方法具有较高的特异性、灵敏度、重现性和稳定性，可用于牛奶样品中多种抗生素残留的检测。

赵福民[33]等制作了能够同时检测牛奶、奶粉中卡那霉素、红霉素、林可霉素三种抗生素的胶体金免疫层析试纸条。那霉素、红霉素、林可霉素检测限分别为50.0、20.0和75.0μg/L，假阳性率和假阴性率均为0，样本无需前处理，检测操作简单，10min内实现3种药物同时检测。采用胶体金试纸条和液相色谱串联质谱法对20份牛奶和奶粉盲样进行比对试验，阳性样品全部检出，2种方法测定结果一致。结果显示，该法检测准确可靠，适用于现场大批量样本的快速检测和筛选。

1.5 流动注射免疫分析法

流动注射免疫分析法[34](Flow-Injection Immunoassay,FIA）是一种自动程度较高的免疫分析法，它可以由计算机控制缓冲液的流速、自动进样、检测器的检测及数据处理等，可对临床生物样品、低分子药物浓度的临床监测及环境污染物，如农药、兽药及其代谢产物的含量进行测定。FIA可分为均相和非均相两种，前者不涉及分离步骤，但由于样品中杂质对测定的干扰比较重，故在使用上受到了一定的限制；后者则需要用固相载体将结合的和未结合的标记物分开，这样就能充分的将未结合的标记物和样品中的杂质成分快速除去，提高了检测的灵敏度和重复性。

Luo Liegao[36]等建立了一种基于金纳米颗粒酶的简单、超灵敏的流动注射化学发光竞争性免疫分析方法，用于检测虾和蜂蜜中的氯霉素（CAP）残留。以具有良好的生物相容性和较大的比表面积的羧酸树脂珠作为固相载体，以固定更多的包被抗原（Ag）。

此外，金纳米粒子可以提供一个有效的基质，以加载更多的CAP抗体和辣根过氧化物酶，这将有效地催化鲁米诺-对碘苯酚（PIP)-H2O2系统。使用该法检测CAP，其中样品中的CAP将与包被Ag竞争有限的抗体，导致化学发光（CL）信号随CAP浓度的增加而降低。在优化条件下获得了0.001～10ng/m L的宽线性范围（R2=0.9961），计算出的检出限（3sigma）为0.33pg/m L。该方法也已成功地用于测定虾和蜂蜜样品中的CAP。本研究提出的免疫传感器不仅具有灵敏度高、线性范围宽、稳定性令人满意的优点，而且扩大了流动注射化学发光免疫测定在抗生素检测中的应用。

1.6 放射免疫分析法

放射免疫分析法[37](Radioimmunoassay,RIA）是一种将放射性同位素测量的高度灵敏性、精确性和抗原抗体反应的特异性相结合的体外测定超微量（10-9～10-15g）物质的新技术。RIA法的优点[38]：具有一般分析方法所不具备的高灵敏性，最低检出限能低至纳克（ng,10-9g）～飞克（fg,10-15g）；抗原抗体的高特异性决定了RIA法的高特异性，如氯霉素类抗体只能与氯霉素抗原结合；除此之外，该法还具有方法简便、快捷、易于自动化、便于推广等优点。

Araby Eman等建立了测定牛肉中四环素（TE）和依托霉素（ST）的放射免疫分析法，并分离和鉴定了相关的高抗性细菌菌株。除了研究γ射线对此类耐药菌株对TE和ST的敏感性的影响外，在所有收集的样品中均检测到四环素（TE），而ST在肉类和肝脏中的检出率分别为38.46%(5/13）和87.5%(7/8）。分别从肉类和肝脏样品中分离出51个细菌分离株，其中对TE或ST耐药性最高的分离株被鉴定为长鞭虫属的链球菌、奇异变形杆菌（2个分离株）和大肠杆菌（3株）。

SU Ming-Ming采用CharmⅡ放射免疫法测定牛血清中的磺胺类药物残留。收集6份血清样品进行加样试验，将样品测试的结果与对照点进行比较。评估了免疫反应系统的敏感性和特异性。将测量值与控制点进行比较，如果测量值大于控制点，则样品为阴性；而如果测量值小于控制点，则样品为阳性。结果可在短时间内获得测试结果，四环素的检出限为20μg/kg。该方法具有高度的特异性，操作简便。

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