基于碘化钾-淀粉显色光度法测定过氧化氢酶活性（一）

过氧化氢酶(CAT)为含铁卟啉的结合酶，是一种广泛存在的抗氧化酶，能清除食品、食品添加剂和配料在消毒灭菌、漂白、加工后产生或残留的过氧化氢，也能清除奶制品等食品在紫外线照射时产生的过氧化氢造成的异味，因此测定CAT活性在食品检验领域具有重要意义。酶的活性一般通过底物的变化来测定，而酶促反应具有高度特异、高效、不稳定和可调节等特点，因此测定CAT活性的方法多种多样。高锰酸钾滴定法因所用设备简单，作为国家标准和教学实验一直被使用，但高锰酸钾不稳定，试剂溶液标定难，保存难，滴定过程中不可避免地存在较大的人为判断误差。当前化学动力学光度法成为一大亮点，董等以二苯胺磺酸钠为底物完成CAT显色动力光度法测定，但显色灵敏度有限，H₂O₂表观摩尔吸光系数ε＜5.0×10²L／(mol·cm)。本文以碘量法为基础，构建碘化钾-淀粉显色光度法测定CAT活性的新体系。在硫酸介质中，双氧水氧化碘化钾生成碘，碘与淀粉快速反应呈现蓝色，显色液在600nm波长处有最大吸收峰。CAT催化H₂0₂分解，通过CAT加入前后吸光度变化值实现酶活性测定。该方法简单，原理清晰，耗材少，相对高锰酸钾滴定法，检测限更低，非常适合于生物样品微量CAT活性分析。本实验用μtmol／mL(U／mL)来表示酶液的酶活性，即lmL过氧化氢酶溶液所消耗过氧化氢物质的量(μm01)。

一、实验部分

1、仪器与试剂

7230G型可见分光光度计(上海公司)；分析天平(0.1mg，上海天平仪器厂)。

CAT标准品(上海鼓臣生物技术有限公司)储备液：配制浓度lmg／mL(活性约为5000U／mL)，碘量法标定；CAT工作液：0.1U／mL(使用前由储备液稀释)；H₂0₂基质液：1μmol／mL(取0.6mL，3％H202稀释至500mL)；0.1mol／LH₂S0₄溶液；0.01mol／L碘化钾溶液；5g／L淀粉液；0.1mol／L磷酸盐缓冲溶液(pH=7.0)。

2、测定方法

取50ml容量瓶一只，加入CAT样液(酶活性小于2U／mL)1.00mE、H₂0₂基质液2.00mL，25℃水浴反应30min后立即加入1.5mL硫酸终止反应，加碘化钾5mL，60℃水浴加热40min，冷却，加淀粉3mL，定容，以蒸馏水作参比液，在波长600nm处测吸光度A，同时完成酶空白试验吸光度A₀测定，根据△A(△A=A₀一A)确定过氧化氢酶活性E。

二、结果讨论

1、吸收光谱与最大吸收波长

不同体系吸收光谱见图1。淀粉与碘化钾溶液在可见光区无吸收峰(图1曲线1)；淀粉、碘化钾与过氧化氢溶液中，过氧化氢氧化碘化钾，淀粉溶液呈蓝色，600nm处有最大吸收(图1曲线3)，峰形尖锐，峰值较高，H₂O₂表观摩尔吸光系数ε₆₀₀=2.79×10⁴L／(mol·cm)；加入CAT后，显色受抑制(图1曲线2)，但峰位未发生改变，这说明反应仅存在于过氧化氢与碘化钾之间，显色程度与过氧化氢含量有关。实验选取600nm作测定波长。

2、碘化钾用量影响

仅针对非酶体系(E=0U／mL)，单纯考察了碘化钾用量影响。结果表明，A随碘化钾体积增大，在0～3mL之间，增幅较快，大量的碘化钾被氧化；在3～5mL之间，增幅放缓，这时的碘化钾主要作为助溶剂，I₂是非极性分子，水溶性差，过量碘化钾促使碘合离子形成(I₂+I^-=I^-₃)，溶解能力增强。显然，过量碘化钾有效改善了显色环境，5mL时A恒定不变。实验选择5mL碘化钾。

3、淀粉用量

用该方法取50ml容量瓶一只，加入CAT样液(酶活性小于2U／mL)1.00mE、H₂0₂基质液2.00mL，25℃水浴反应30min后立即加入1.5mL硫酸终止反应，加碘化钾5mL，60℃水浴加热40min，冷却，加淀粉3mL，定容，以蒸馏水作参比液，在波长600nm处测吸光度A，同时完成酶空白试验吸光度A₀测定，根据△A(△A=A₀一A)确定过氧化氢酶活性E。其他条件不变，考察了淀粉用量影响。结果表明，在0～2.75mL之间，A随淀粉体积增大，2.75mL后，A趋于恒定。实验选择3mL淀粉作显色剂。

4、硫酸用量

取50ml容量瓶一只，加入CAT样液(酶活性小于2U／mL)1.00mE、H202基质液2.00mL，25℃水浴反应30min后立即加入1.5mL硫酸终止反应，加碘化钾5mL，60℃水浴加热40min，冷却，加淀粉3mL，定容，以蒸馏水作参比液，在波长600nm处测吸光度A，同时完成酶空白试验吸光度A₀测定，根据△A(△A=A₀一A)确定过氧化氢酶活性E。其他条件不变，考察硫酸体积对显色反应影响，并同步完成pH测定(图2)。结果表明，当V(H₂SO₄)=1.5mL时，pH=1.80，显色最完全，A值达到最大。0.1mol／LH₂SO₄溶液最佳用量为1.5mL。

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