次磷酸钠对肉制品中肉毒梭状芽孢杆菌(生孢梭菌)的抑制效果研究（二）

（1）SHP对生孢梭菌抑菌效果

配制0mg/L、250mg/L、500mejL、1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L标准SHP溶液，分别用1～7号表示，SHP对生孢梭菌的抑菌圈直径见下图。图2中，1号到7号都有明显的抑菌圈。1号到5号抑菌圈的直径都是9.5mm，而到6号抑菌圈扩大为12.0mm，到了7号抑菌圈变为13.0mm。1号至5号出现的明显抑菌圈，可能由于生孢梭菌吸水裂解，也可能因为生孢梭菌是严格的厌氧菌而蒸馏水中含有一定量的氧气使得生孢梭菌死亡；6号和7号抑菌圈明显变大，说明SHP对生孢梭菌有明显抑菌效果，且SHP的抑菌效果随浓度的增加而增强。

（2）SHP对生孢梭菌抑菌效果

配制0mg/L、250mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L标准SHP溶液，分别用1～7号表示，SHP对产气荚膜梭菌的抑菌圈直径见下图。

图3中，1号到7号都有抑菌圈，抑菌圈的直径几乎相等都是8.5mm，6号抑菌圈扩大为9.1mm，7号抑菌圈变为10.0mm。1号至5号出现了抑菌圈，可能是由于产气荚膜梭菌吸水裂解，虽然产气荚膜梭菌不是严格的厌氧菌，但也可能因为蒸馏水中含有大量的氧气使得生孢梭菌死亡；6号和7号抑菌圈明显变大，说明SHP对产气荚膜梭菌有明显抑菌效果，且SHP对产气荚膜梭菌的抑菌效果也随浓度的增加而增强。

（3）SHP对肉制品中常见有害菌的抑菌结果

表2中，大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的空白组结果与所有实验组结果基本一样，没有明显的差异，说明SHP对这四种菌均无抑菌作用；大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的结果都没有抑菌圈，而蜡样芽孢杆菌的所有结果都为10.Omm，抑菌圈较清晰明显，猜测蜡样芽孢杆菌对蒸馏水较敏感，可能由于蜡样芽孢杆菌在水中容易裂解死亡。

以上图表可以得出，SHP对革兰氏阳性菌（生孢梭菌和产气荚膜梭菌）有明显抑菌作用；SHP对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌）没有抑菌效果；SHP对革兰氏阴性菌（大肠杆菌、沙门氏菌）没有抑菌作用，推断出SHP对革兰氏阳性厌氧菌有抑菌作用。

2、最小抑菌浓度

最小抑菌浓度（MIC）是指在特定的培养条件下，某种微生物的增长出现明显下降的最低浓度，一般用来评定抑菌剂对微生物的抑菌效果。最小抑菌浓度的测定对新型抑菌剂的探索有着非常重要的意义，可以决定SHP是否具有抑菌剂的功效。严佩峰，张孔海等研究了培养液中活菌数与吸光度的关系，认为菌液中活菌数与其对应的吸光度呈线性相关关系。本试验通过测量不同浓度SHP处理的两种菌液在600nm下的吸光度，将对照组的OD值与实验组的OD值进行对比，从而来确定生孢梭菌和产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度。

小抑菌浓度。配制SHP溶液从2000mg/L至3000mg/L，六个浓度梯度（见图4），测定SHP对生孢梭菌和产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度，结果如下：

折线图可以看出，生孢梭菌被0～2600mg/L的SHP溶液处理时，OD值几乎不变，而OD值在SHP浓度2600mg/L处开始急剧下降，说明在偏弱酸性环境下，36℃培养24hSHP对生孢梭菌的最小抑菌浓度（MIC）为2600mg/L；且随SHP浓度的增加OD值下降，说明SHP对生孢梭菌的抑菌作用随着浓度的增加而增强。

产气荚膜梭菌被0～2800mg/L的SHP溶液处理时，OD值几乎不变，而OD值在SHP浓度3000mg/L处开始急剧下降，说明在偏弱酸性环境下，36℃培养24hSHP对产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度（MIC）为2800mg/L。通过实验结果可以看出，产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度比生孢梭菌的大，SHP对生孢梭菌的抑菌效果好于产气荚膜梭菌，这一结论与抑菌圈实验的结论是一致的。

3、SHP对生孢梭菌的最佳抑制条件摸索

为研究SHP对生孢梭菌的最佳抑制条件，本实验设计L₉（3⁴）正交试验，选择温度、时间、PH这三个因素，测定抑菌圈的结果如下：

表3中，8号、2号、3号、9号是九组中抑菌圈里比较大的四组，从大到小排序为：9＞3＞2＞8。表3中，可以得出A₃B₃C₂为最佳组合，得出最佳抑菌条件为：温度40℃，培养时间为20h，pH为6.0（偏酸性）；主次因素的排序为：B（时间）＞C（培养时间）＞A（pH）。经对各因素显著判断方差分析结果表明，温度、培养时间，这三个因素对SHP对生孢梭菌生长的抑制影响不显著，说明在SHP抑制生孢梭菌生长过程中，生孢梭菌具有较好的热稳定性，且具有较大的pH作用范围。

三、结论

本研究采用不同浓度梯度的SHP溶液对肉制品中的常见有害菌（生孢梭菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌）进行抑菌处理，结果显示，SHP对革兰氏阳性菌（生孢梭菌和产气荚膜梭菌）有明显抑菌作用，且随着SHP浓度增加抑菌效果增强；SHP对革兰氏阴性菌（大肠杆菌、沙门氏菌）没有抑菌作用，推断出SHP对部分革兰氏阳性厌氧菌有抑菌作用。SHP对生孢梭菌的最小抑菌浓度（MIC）为2800mg/L；SHP对产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度（MIC）为3000mg/L。为SHP可以替代亚硝酸盐在肉制品中对肉毒梭菌有效抑制提供了数据支持。

通过SHP对生孢梭菌的最佳抑菌条件试验，得出最佳抑菌条件为：温度40℃，培养时间为20h，pH为6.0（偏酸性），经各因素显著方差分析，温度、培养时间，这三个因素对SHP对生孢梭菌生长的抑制影响不显著，说明在SHP抑制生孢梭菌生长过程中，生孢梭菌具有较好的热稳定性，且具有较大的pH作用范围。次磷酸钠对肉制品中肉毒梭状芽孢杆菌（生孢梭菌）的抑制研究，有利于控制肉制品中肉毒梭状芽孢杆菌生长，有利于减少肉制品中有毒添加剂一亚硝酸钠添加量甚至取代其添加，对肉制品行业向将健康安全发展起着重要作用，加快次磷酸钠替代亚硝酸钠的研究，加紧次磷酸钠生产工艺的改善，使其纯度的提高，积极申请次磷酸钠向食品级添加剂转化，将是次磷酸钠在食品中应用的重点研究方向。

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