茶籽饼生物脱毒工艺的优化（一）

发布时间：2021-03-02 19:23 编辑者：夏德婷

以茶籽饼中茶皂素降解率为主要指标，采用单因素试验和正交试验对嗜酸小球菌固体发酵茶籽饼的生物脱毒工艺条件进行了优化。结果表明，该菌适宜的生物脱毒工艺条件为茶籽饼粕85%、麦麸15%、葡萄糖3%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.15%、NaCl 3%、含水量70%、种龄24 h、发酵时间5 d、接种量20%、初始pH 6.0、发酵温度32℃，在此优化工艺条件下茶籽饼中茶皂素的降解率可达到68.42%，比优化前提高了57.13%。

茶籽饼，又称为茶粕、茶枯，是油茶果实榨油后剩下的渣滓。据国家统计局统计，2010年我国油茶种植面积达到200余万hm2，年产油茶籽109万t，油茶籽粕70多万t。但是，由于茶籽饼粕中含有茶皂素等毒性物质以及单宁、粗纤维等抗营养成分，限制了其在动物饲料中的应用范围。

目前主要采用物理法、化学法、微生物发酵法以及综合法对茶籽饼粕进行脱毒处理，常用的方法有化学法与微生物发酵法。其中，茶籽饼粕微生物发酵脱毒国内外进行了研究。丁丽霞以油茶粕为研究对象，以茶皂素含量为指标，利用黑曲霉对油茶粕进行固态发酵降解茶皂素，在最优工艺条件下降解率达到89.99%。练杰等利用黑曲霉、枯草芽孢杆菌的混合菌对茶籽饼粕进行固态发酵，在最优工艺条件下可使茶籽粕的茶皂素降解率约为93.28%。黄浦利用混菌液态发酵降解茶皂素，在最佳条件下进行混菌液态发酵试验，结果表明混菌降解茶皂素的降解率为(73.76±0.63)%。王小姣等对饲用嗜酸小球菌液体生料发酵工艺研究，结果表明液体生料发酵技术适合于饲用嗜酸小球菌的生产。

笔者以茶皂素降解率为考察指标，对茶籽饼进行微生物固体发酵脱毒工艺进行了研究，首先通过单因素试验法优化发酵培养基的组成(茶籽饼与麦麸的比例、葡萄糖添加量、KH2PO4添加量、MgSO4·7H2O添加量)及发酵条件(含水量、发酵时间、接种量、初始pH、种龄)，然后选取对发酵影响显著的因素进行正交优化。该研究优化了茶籽饼生物脱毒工艺条件，为微生物发酵茶粕饲料提供了发酵工艺条件，为使茶籽饼成为一种优良的蛋白饲料资源打下了坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

试验菌种为嗜酸小球菌(Pediococcus acidilactici)，联合湖南农业大学生物科学技术学院微生物实验室对衡阳市荆田湾农业开发有限公司提供的自然堆放的茶籽饼粕原料进行筛选所得的菌种。

1.1.2 主要试剂

茶皂素标准品(98.2%茶皂素)购自陕西帕尼尔生物科技有限公司；茶籽饼、麦麸(市场购得，无霉变与虫蛀)、葡萄糖、NaCl、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、柠檬酸二铵、无水乙酸钠、吐温-80、香草醛、甲醇(AR级)、浓 H2SO4、牛肉膏、蛋白胨(BR级，上海盛思生化科技有限公司)；酵母膏(BR级，上海天鹅啤酒有限公司)；琼脂、酵母抽提粉。

1.1.3 主要仪器与设备

紫外可见分光光度计(752型，上海光谱仪器有限公司)；恒温水箱(SHHW21.420AII，天津市泰斯特仪器有限公司)；台式低速离心机(TDZ4，湖南赫西仪器装备有限公司)；高速多功能粉碎机(TYSP-400A，浙江省永康市红太阳机电有限公司)；超声波清洗机(JCX-250W，山东济宁超声电子仪器厂)；电子天平(KF型，浙江凯丰集团有限公司)。

1.1.4 培养基

1.1.4.1 MRS培养基(培养嗜酸小球菌)

蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、葡萄糖2%、吐温80 0.1 mL、K2HPO4 0.2%、醋酸钠0.5%、柠檬酸二铵0.2%、MgSO4·7H2O 0.058%、MnSO4· 4H2O 0.025%、蒸馏水100 mL，pH 6.2～6.6，115 ℃下灭菌25 min。

1.1.4.2 基础液体发酵培养基

茶皂素15.0 g、葡萄糖5 g、蛋白胨5 g、KH2PO4 2 g、MgSO4·7H2O 1 g、酵母抽提粉3 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.5，121 ℃下灭菌25 min。

1.1.4.3 基础固体发酵培养基

茶籽饼粕90%、麦麸10%、葡萄糖4%、KH2PO4 0.15%、MgSO4·7H2O 0.1% 、NaCl 3%，pH 7.5，固水比1∶0.5。

1.2 方法

1.2.1 种子液初步培养及固体发酵培养

1.2.1.1 种子液初步培养

将斜面菌种接种于种子液培养基中，于30 ℃﹑160 r/min 条件下培养24 h，备用；嗜酸小球菌接种于MRS培养基中，在培养温度37 ℃的恒温培养箱中静置培养24 h，备用。

1.2.1.2 种子液固体发酵培养。

在250 mL三角瓶中装入50 g 固体发酵培养基(以干基计)，采用接种量为10%(V/w)，将培养好的种子液接入基础固体发酵培养基中，32 ℃恒温培养5 d。

1.2.2 固体发酵样品茶皂素降解率的测定

采用香草醛-浓硫酸法测定固体发酵样品茶皂素的降解率。按照以下公式计算茶皂素降解率:茶皂素降解率=(发酵后茶皂素浓度/发酵前茶皂素浓度)×100%。

1.2.3 固体发酵培养基的优化

保持基础培养基其他组成不变，采用单因素试验法，依次改变培基的茶籽饼与麦麸的添加比例(95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25)、葡萄糖添加量(2%、3%、4%、5%、6%)、KH2PO4添加量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%)、MgSO4·7H2O添加量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%)，等量接种种子液培养液于固体发酵培养基中进行固体发酵。测定发酵前后茶籽饼中茶皂素浓度，以茶皂素降解率为指标，优化筛选不同茶籽饼与麦麸的比例、葡萄糖添加量、KH2PO4添加量、MgSO4·7H2O添加量等对菌种降解茶皂素的影响。每个处理3个平行。

1.2.4 固体发酵条件的优化

通过改变影响发酵的条件，测定发酵前后茶籽饼中茶皂素的浓度，以茶皂素降解率为考察指标，在“1.2.3”优化培养基的基础上，考察含水量、发酵时间、初始pH、接种量以及种龄对茶皂素降解率的影响，研究最佳固体发酵条件。每个处理3个平行。

在单因素试验的基础上，采用正交试验法设计用含水量、初始pH、接种量、种龄等对嗜酸小球菌降解茶皂素影响较大的因素进行4因素3水平正交试验。正交试验因素与水平设计见表1。