耐酸性β-甘露聚糖酶产生菌的筛选鉴定及培养基优化（二）

5、响应面BOX-Behnken试验设计

在单因素实验结果的基础上，对发酵培养基组成进行响应面优化。选取自变量因素为A-魔芋粉、B-酵母浸粉、C-Mn2²⁺，响应值(R1)为酶活。使用软件Design-Expert10.0.7对上述因素进行响应曲面回归分析，对发酵培养基的组成进行优化。BOX-Behnken试验因素水平表如表1:

二、结果与分析

1、菌株的分离与筛选

将富集培养液的稀释液涂布于筛选培养基，产甘露聚糖酶的菌株会在培养基上生长，以此来筛选菌株。挑选长势良好且菌落直径大的10株单菌落进入复筛，并命名为NSG-1、NSG-2、....NSG-10。

将筛选得到的10株菌进行摇瓶发酵，用DNS法测定粗酶液酶活力。结果如图1所示，NSG-6在经耐酸性实验后酶活力为1.78U/mL相对最高，其正常酶活力为2.05U/mL，故将其作为供试菌株。

2、菌株鉴定

PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果即Marker组成见图2。Marker中3000bp、1000bp和500bp条带浓度为60ng/3μL显示为加亮带，其余条带浓度均为30ng/3μL，电泳方向从上向下。从电泳结果可知:PCR扩增产物条带清晰、没有拖尾现象，且分子量在1400bp左右与16SrDNA片段相符，可进行后续实验。

测序结果如图3所示，NSG-6的16SrDNA序列共1473bp。将该序列提交至NCBI进行BLAST，然后用软件MEGAX对16SrDNA序列进行同源性比对，部分结果见表2。采用邻近连接法构建NSG-6与有关细菌16SrDNA的系统发育树(相似的重复计算1000次)，结果见图4。由同源性比对结果和系统发育树可知，NSG-6与EnterobacterludwigiiEN-119(NR042349.1)相似性达到100%，判断其为路德维希肠杆菌。

3、响应面Box-Behnken试验设计优化结果

（1）响应面设计结果

单因素实验结果如下，培养基组成:魔芋粉2.5%、酵母浸粉2.5%、MnSO₄0.5%；发酵条件:自然pH、接种量2.00%、发酵温度35℃、摇床转速230r/min。

运用软件Design-Expert10.0.7对培养基组成进行响应面设计，结果见表3。再对其数据进行多元回归拟合，获得多元线性回归模型:

R1=4.85+0.84A+0.20B-0.26C+0.11AB-0.25AC+0.27BC+0.35A₂-0.24B₂-0.63C₂R₂=0.9958

其中R1是预测的甘露聚糖酶的酶活，A是魔芋粉添加量，B是酵母浸粉添加量，C是硫酸锰添加量。

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