连翘叶乙醇提取物抗小鼠蓖麻油性腹泻活性及其对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响研究（一）

背景 中医药治疗腹泻具有疗效迅速、不良反应少、费用低廉等优势。连翘具有清热解毒、消肿散结的功效，目前就其治疗腹泻方面的研究鲜有报道。目的 观察连翘叶乙醇提取物(FS ext)对小鼠蓖麻油性腹泻的影响，并研究其对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响及其作用机制。

方法 2018年6—12月，于四川省南充市采集连翘叶并经提取得到FS ext，采用高效液相色谱法分析FS ext的化学成分；取60只禁食4 h(可自由饮水)的小鼠随机分为0.5 g/kg FS ext试验组、1.0 g/kg FS ext试验组、2.0 g/kg FS ext试验组、4.0 g/kg FS ext试验组、8.0 g/kg FS ext试验组、16.0 g/kg FS ext试验组，每组10只，分别给予0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg、4.0 g/kg、8.0 g/kg、16.0 g/kg的FS ext进行灌胃，记录14 d内小鼠的死亡情况和毒性迹象，建立相应的剂量-效应曲线，从而确定FS ext的半数致死剂量(LD50)，以确定其安全性。另取50只小鼠随机分成阴性组、阳性组、0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组、1.00 g/kg FS ext试验组，每组10只，阴性组给予0.9%氯化钠溶液(20 ml/kg)灌胃，阳性组给予洛哌丁胺(4 mg/kg)灌胃，0.25g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组、1.00 g/kg FS ext试验组分别给予0.25、0.50、1.00 g/kg FS ext。

给药30 min后，小鼠均给予蓖麻油0.4 ml灌胃，观察4 h内以下指标：初始半固体粪便时间，固体、半固体、液体粪便数量。采用腹泻指数(EI)评估腹泻的严重程度。取42只健康家兔，制备离体空肠平滑肌，观察FS ext对离体空肠平滑肌自发性收缩的影响：分别用乙酰胆碱(ACh，10μmol/L)和氯化钾(KCl，60 mmol/L)预处理离体空肠平滑肌，来探究FS ext对其诱导的离体空肠平滑肌自发性收缩的影响；用含FS ext或维拉帕米(1μmol/L)的无Ca2+高K+台式液预处理离体空肠平滑肌，然后累计CaCl2进一步研究其机制。结果 FS ext中主要含连翘苷和连翘酯苷A等化学成分；小鼠按不同剂量的FS ext进行灌胃后，在观察期内未出现任何死亡或毒性迹象。

阳性组初始半固体粪便时间长于阴性组、0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组(P<0.05);1.00 g/kg FS ext试验组初始半固体粪便时间长于阴性组、0.25g/kg FS ext试验组(P<0.05)。阴性组EI高于阳性组、1.00 g/kg FS ext试验组(P<0.05);0.25 g/kg FS ext试验组、0.50g/kg FS ext试验组EI高于阳性组(P<0.05)。FS ext(0.01～10.00 mg/ml)以剂量依赖性的方式抑制家兔离体空肠平滑肌的自发性收缩，并抑制由ACh和KCl诱导的空肠收缩，同时，FS ext也能抑制CaCl2诱导的空肠平滑肌自发性收缩，并使CaCl2量-效关系曲线右下移，与维拉帕米引起的CaCl2量-效关系曲线变化类似。

结论 FS ext有明显的抗小鼠蓖麻油性腹泻作用，并能抑制家兔离体空肠平滑肌的自发性收缩及ACh和KCl诱导的空肠收缩，其机制可能与阻断M受体和抑制L-型钙离子通道有关。
腹泻通常是由肠道疾病引起的症状，可由各种细菌（大肠埃希菌、志贺菌种、霍乱弧菌等）、病毒（诺如病毒、巨细胞病毒等）和寄生虫引起。腹泻是严重影响人类健康和社会经济发展的多发病之一，尽管治疗腹泻的有效药物较多，但中药治疗腹泻具有疗效迅速、不良反应少、费用低廉等优势[2]。因此，世界卫生组织（WHO）仍鼓励寻找传统的抗腹泻中药。

连翘是临床常用中药之一，为木犀科植物连翘Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实，味苦、无毒、性微寒，具有清热解毒、消肿散结的功效，其药理作用主要有抗菌、保肝、非特异性免疫、保护心脏、抗氧化等。有研究表明，连翘属植物叶子与果实的成分和药理作用有较好的一致性，而连翘叶中的黄酮类化合物具有良好的抑菌活性，更好地印证了其药理作用。

本研究采用蓖麻油诱导的小鼠急性腹泻模型，观察连翘叶乙醇提取物（FS ext）对小鼠蓖麻油性腹泻的影响，同时探讨其对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响。

1 材料与方法

1.1 研究时间

2018年6—12月。

1.2 药物提取

于四川省南充市采集连翘叶（CBY-2016-0003），经川北医学院药学院梅雪老师鉴定。将连翘叶放在恒温（60℃）电炉中干燥，粉碎成粗粉（粉碎机：FW177，泰斯特，天津），取50 g（使用电子分析天平：Mettle AE 240）放入1 L的圆底烧瓶中，用7倍于测量质量的乙醇作为溶剂，回流、萃取3次，滤液回收溶剂（旋转蒸发器：RE-52AA，雅荣，上海）浓缩，在真空减压干燥炉（ZK 6050B，Opson，武汉）中干燥得到FS ext，浸出率为24.55%。

1.3 植物化学分析

1.3.1 初步植物化学分析

对FS ext进行植物化学分析，以确定可能存在的苷类、多酚、黄酮类、多糖和有机酸[7]。水提液振荡后形成泡沫，说明FS ext中有皂苷；加入FeCl3试剂出现蓝绿色，说明FS ext中有酚类物质；加入AlCl3试剂出现黄色，说明FS ext中有黄酮类物质。

1.3.2总黄酮含量测定

根据文献[8]测定FS ext的总黄酮含量。将0.5 ml FS ext与1.5 ml乙醇（75%v/v）、0.1 ml氯化铝（10%w/v）、0.1 ml乙酸钾（1 mol/L）和2.8 ml双蒸馏水混合，室温下培养30 min，然后用1750紫外-可见分光光度计（日本岛津）在435 nm处测量吸光度。用蒸馏水（0.1 ml）代替氯化铝作空白。芦丁有典型的黄酮类结构和紫外特征，且易分离，作为对照品比较易得，故本研究以芦丁作为标定曲线的标准对照，结果用芦丁当量mg/g提取物表示。

1.3.3 高效液相色谱法鉴别FS ext中的化学成分

采用高效液相色谱法对FS ext中的化学成分进行鉴别和检测，色谱柱为Aglient-ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5μm），以乙腈-水溶液为流动相，采用梯度洗脱（流动相A为水，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件见表1），结合波长切换技术于20 min将检测波长从330 nm切换为277 nm进行化学成分检测，流速为0.6 ml/min，柱温28℃，进样量5μl。

1.3.3. 1 对照品溶液制备

取连翘苷和连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1 ml含0.265 mg连翘苷和0.373 mg连翘酯苷A的混合对照品溶液，混匀，过0.22μm微孔滤膜，备用。

1.3.3. 2 供试品溶液制备

取FS ext 0.105 50 g，加甲醇定容至1 ml容量瓶中，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

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