噬菌体作为新型食品抗菌剂的风险评估与风险规制（二）

2. 噬菌体作为食品抗菌剂的风险评估

2.1 安全性评估

2.1.1 广泛存在性

噬菌体存在于环境中的每一个角落，是地球上总量最丰富的物种之一。在自然环境中，噬菌体几乎无处不在，研究表明其在水体中密度高达 108 PFU/mL，在土壤中密度约为 1.5×108 PFU/g。在果蔬肉类中，噬菌体普遍存在，Allwood 等对采集于农贸市场的果蔬样品进行检测，发现在洋葱、卷心菜、萝卜、草莓等多种样品中存在大肠杆菌噬菌体；Endersen 等对鸡肉、牛肉、猪肉、鱼肉、脱脂牛奶等肉禽类食品样本进行检测，均发现超过 50%的样品中都有噬菌体的存在。在健康人体中，噬菌体的踪迹也不难寻觅，人体口腔、肠道、尿液和血液中均存在大量的内源性噬菌体，其中人体肠道中噬菌体数量多达 1015 个，这些内源噬菌体在抵抗病原菌、自动调节人体微生态方面发挥着重要作用。此外，据 Lim 等的研究，0～2 岁婴幼儿的粪便中同样存在噬菌体，且该噬菌体序列并不来源于婴儿母乳或配方奶，表明摄食不是人体内噬菌体的起始来源。

人体长期暴露于大量噬菌体存在的环境中，但还未见任何有关噬菌体感染人体的报道。虽然内源性噬菌体仍未被证明为类似益生菌的严格益生微生物，但随着此类研究的不断拓展和深入，对于噬菌体的应用安全性将有更确切的答案，同时也有助于消除公众因其是一种“病毒”而产生的本能的恐惧和抵触。

2.1.2 临床试验安全性

近年来，已有大量噬菌体制剂作用于相关动物试验，受试对象包括小鼠、家兔、鸡、猪、牛、羊等。试验结果均表明，噬菌体制剂的安全性较高。例如，Hwang 等以小鼠为受试对象，将噬菌体制剂提高至常用剂量的 3 500 倍，经肌肉、腹腔和静脉注射后，未出现不良反应和毒理作用Kishor等以家兔作为试验对象，口服噬菌体制剂治疗由葡萄球菌引起的慢性骨髓炎，试验组未发现明显副作用；Duenas 等则以牛和羊为受试对象，接受大肠杆菌噬菌体治疗，试验组牛、羊体内大肠杆菌O157:H7 平均数目减少，且未见不良反应。

在相关人体临床试验中，噬菌体临床治疗在东欧地区历史悠久，欧美等国近些年开展的人体临床试验也证明噬菌体具有较好的安全性。例如，Bruttin 等给 15 名健康成年志愿者口服噬菌体 T4，受试者体内血清中谷丙转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平均正常，肠道内正常菌群未受影响；McCallin 等使用一种俄罗斯噬菌体口服制剂进行人体试验，数名健康成人志愿者随机口服高剂量、低剂量噬菌体制剂和安慰剂，之后每周进行一次全面身体检查，未见任何异常；Sarker 等以孟加拉国的儿童志愿者为受试对象，将 105～107 PFU/mL 的噬菌体制剂、安慰剂随机口服给平均年龄 4 岁的数名儿童，经检测，儿童口服噬菌体后并未发生噬菌体复制，临床观察和血液学观察指标均正常，口服噬菌体对儿童粪便微生物组分也未产生影响。

然而不可忽视的是，上述多数研究仍以疗效评价作为主要评价项目，在涉及安全性确证的方面缺乏一定的规范性与系统性。

2.2 有效性评估

目前，噬菌体在中国还未被批准作为食品添加剂使用，但是在国内外的相关研究中已经取得了较理想的抗菌效果。使用噬菌体能够对猪肉、香肠、番茄、生菜、奶酪、熟牛肉、鸡肉、水产品等食品中致病菌的生长起到显著抑制的作用，甚至可以有效降解食品工业中的杀手生物被膜。

在肉类制品中的应用，如 Galarce 等使用鸡肉香肠和意大利萨拉米肠测试了 5 种裂解性噬菌体鸡尾酒对肠炎沙门氏菌的裂解效果，试验将肉制品样品预先以肠炎沙门氏菌污染，后以噬菌体处理，在18 ℃和 4 ℃条件下培养 10 d 后，肠炎沙门氏菌菌落数量明显降低，且噬菌体效价可保持稳定；在乳制品中的应用，如 Endersen 等研究了 6 种分枝杆菌噬菌体与噬菌体鸡尾酒对脱脂牛乳中耻垢分枝杆菌的抑制作用，研究发现单一噬菌体在 37 ℃条件下可在 4 d 内使脱脂牛乳中细菌细胞数降低 6～7 个对数单位，6 种噬菌体混合后的噬菌体鸡尾酒则能够在相同条件下完全清楚耻垢分枝杆菌；在海鲜制品中的应用，如 Guenther 等利用即食鲑鱼测试了一种抗单增李斯特菌噬菌体鸡尾酒的抑菌效果，研究表明噬菌体鸡尾酒使单增李斯特菌计数降低至少 5 个数量级；在新鲜果蔬中的应用，如李锦铨等利用噬菌体 LPSE1 和 LPST10 测试其对生菜中肠炎沙门氏菌 ATCC13076 和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 的抑菌作用，研究发现噬菌体 LPSE1、LPST10 作用 4 h 左右后细菌数量逐渐减少，当感染复数为 100 时裂菌效果最佳，且随着作用时间增加，菌量可持续减少。

3. 噬菌体作为食品抗菌剂的域外进展

域外已经有不少批准噬菌体作为食品抗菌剂的先例。美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）于 2006 年首次通过了用于食品中的噬菌体产品申请，即主要用于控制、杀灭即食食品中单增李斯特菌的数量的噬菌体制剂 List Shield TM，这也是 FDA 将噬菌体视为公认安全添加剂(Generally Regarded As Safe，GRAS)的开端，紧接着 List Shield TM又获得了澳洲和新西兰的特批。此后，许多用于食品中的噬菌体制剂也相继通过审批，如由荷兰 EBI Food Safety 公司开发的针对单增李斯特菌属的 Phage Guard Listex，和针对沙门氏菌属的 Phage Guard S，其可用于熟肉、家禽、鱼肉及各种乳制品中，该 Phage Guard 系列产品已被批准为即食食品加工助剂使用，且不需要特殊的标签说明。2011 年，针对大肠杆菌 O157:H7 的噬菌体制剂 Eco Shield TM获批用于红碎肉中，其有效率稳定在 95%以上。2013 年，针对沙门氏菌的噬菌体制剂 Salmo Fresh TM获批用于禽类肉制品及其他食品中。表 1 列举了部分通过 FDA 批准的GRAS 产品信息。以美国对于噬菌体食品抗菌剂的规制为例，美国的食品添加剂使用规定于《美国联邦法规》(Code of Federal Regulations，CFR)中 21 章 172～178 条的部分。分为直接食品添加剂、次级直接食品添加剂和间接食品添加剂的使用规定。噬菌体归属于直接食品添加剂的 H 部分。其中§172.785 是关于李斯特菌特异性噬菌体制剂的规定，对可用于添加剂的李斯特菌噬菌体的安全性有一些限定性规定，例如，“该添加剂由六种不同的经过单独纯化的抗李斯特菌噬菌体混合而成”“该添加剂是由一个或多个李斯特菌细胞培养物在安全合适的营养培养基中生产的”“在制剂中存在的噬菌体不能包含 40 CFR 725.421（D）中描述的任何毒素编码序列部分”等。对于噬菌体的效价规定为“添加剂中每个单噬菌体的平均噬菌体效价应为 1×109 PFU/mL”。从 2018 年起，美国已经开始有对噬菌体残留限量的豁免规定。2019 年 4 月 23 日，美国环境保护署对 40 CFR 180.1365 部分进行了修订，规定：当对噬菌体进行测序，在得到不含有毒素和溶原性基因的序列的情况下，豁免在所有食品中或所有食品上的免抗链霉菌活性溶解性噬菌体的残留，使用时按照标签上的说明和良好农业规范。这一举措表明了美国当局对噬菌体作为食品添加剂使用安全性的进一步认可。

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