华北车前提取物的抑菌活性及其稳定性研究（一）

华北车前（Plantago asiatica L.）又名车前草、车轮草，为车前科车前属多年生双子叶草本植物，味甘，性寒，生长适应性强，产中国多省地。华北车前可以药食两用，其味道甘甜，营养成分丰富，含有多糖、皂苷、醌类、氨基酸及微量元素等多种成分，具有增强免疫功能、抗疲劳、抗氧化等功效。目前开展与华北车前提取物相关的研究较少，本实验开展华北车前提取物的抑菌活性及其稳定性研究，旨在对其进一步的开发利用有着积极的意义。

目前，国内外提取的工艺主要有溶剂浸提、超声提取以及微波提取等，本实验针对华北车前具有较高生物活性的特点，选用溶剂浸提工艺最大程度保留华北车前提取物的活性。分别研究不同种类溶剂及浓度对华北车前提取物取的抑菌活性的影响，并对制得的华北车前提取物进行稳定性分析，为华北车前提取物的提纯和开发利用提供科学的参考依据，能让其发挥最大的市场经济价值。

一、材料与方法

1、材料与试剂

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪链球菌、沙门氏菌：中国国家标准物质研究中心实验室；乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚：洛阳昊华化学试剂有限公司；华北车前：购买于当地药材市场。

2、仪器及设备

高速万能粉碎机：北京科伟永兴仪器有限公司；控温摇床培养箱：苏州市AIBOER科技技有限公司AG3000；台式培养箱：上海景迈仪器设备有限公司YT230。

3、实验方法

（1）华北车前干粉制取

将华北车前干物质粉碎，过20目筛。

（2）提取方法

①水提取法

采用煎煮方式：称取10g华北车前干粉，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸馏水，沸水提取4次，每次1h，合并四次提取液，抽滤。将滤液旋蒸至10mL，放至-4℃冰箱中保存备用。

②乙醇提取法

取50g华北车前干粉置于500mL烧杯中，加入400mL乙醇，料液比为1∶8（g/mL），使用磁力搅拌器搅拌4h，控制温度为70℃恒温，抽滤回收滤液。滤液在水浴50℃温度下分三次旋蒸至浓稠状无酒精味溶液，合并三次提取液得浸膏，旋蒸浓缩至干，放至-4℃冰箱中保存备用。

③丙酮浸提法

称取10g华北车前干粉，分别用40mL、30mL、30mL丙酮浸提三次，浸提时间分别为2h、lh、1h。每次浸提后减压抽滤，留滤液，滤渣继续浸提。5mL丙酮冲洗滤渣并抽滤，合并四次滤液，旋蒸浓缩至干，放至-4℃冰箱中保存备用。

④乙醚浸提法

称取109华北车前干物质于250mL碘量瓶，加入无水乙醚200mL，常温浸泡4h，抽滤，旋蒸浓缩至干，放至-4℃冰箱中保存备用。

⑤乙酸乙酯提取法

采用索氏提取法，使用250mL索氏提取器，按料液比1∶20（g/mL）称取华北车前干粉5g，用100mL乙酸乙酯进行索氏提取，在恒定温度70℃下提取3h，抽滤，收集滤液。旋蒸至干，放至-4℃冰箱中保存备用。

（3）供试菌种的活化及菌悬液的制备

培养基的配制及供试菌的活化参照沈萍等的方法。将活化的供试菌种转接后于37℃培养24h，待菌体达到对数生长期后，用无菌生理盐水制成菌体浓度为106～10-7CFU/mL的菌悬液，待用。

（4）抑菌活性的测定

采用滤纸片扩散法：选择圆形滤纸片，160℃干热灭菌2h，将用不同药液浸泡过的滤纸片等距放置在涂有菌液的平皿上，于37℃培养24h。用十字交叉法测量抑菌圈直径，记录数据，取平均值。

（5）与抗生素抑菌活性对比无菌条件下，取100此指示菌悬液均匀涂布于LB培养板上，35min后将浸泡95％乙醇的华北车前提取物的无菌滤纸片圆片，贴附到指示菌平板上，同时做氯霉素、强力霉素、杆菌肽、庆大霉素、青霉素等药敏试纸的对比试验，每个处理重复3次，37℃培养ld，观察各培养板指示菌的生长状况及抑菌圈大小，测定各处理抑菌圈直径，即为相应样品抑菌圈值。

（6）最低抑菌浓度（MIC）

将华北车前提取物配制成7个浓度梯度以及一个空白对照，采用滤纸圆片扩散法，分别测定。

对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪链球菌和沙门氏菌的MIC值。

（7）华北车前提取物稳定性实验

①pH对华北车前提取物稳定性的影响将华北车前提取物提取液分别调节pH至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，静置1h后，在325mm波长下测定其吸光度，分析不同pH对华北车前提取物稳定性的影响。

②光照对华北车前提取物稳定性的影响将华北车前提取物提取液分别置于太阳光照、室内以及避光环境中，每隔1h，在325mm波长下测定其吸光度，分析光照对华北车前提取物稳定性的影响。

③温度对华北车前提取物稳定性的影响将华北车前提取物提取液分别在温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的条件下水浴加热1 h后冷却至室温后，在325mm波长下测定其吸光度，分析温度对华北车前提取物稳定性的影响。

④氧化剂和还原剂对华北车前提取物稳定性的影响 分别配制浓度为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％的氧化剂H202以及浓度为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％的还原剂Na2S03。将华北车前提取物提取液每份10mL分别加入不同浓度的氧化剂和还原剂1mL摇匀，另取一份10mL加入1mL蒸馏水作为空白试验。然静置1 h后，在325mm波长下测定其吸光度，氧化剂和还原剂对华北车前提取物稳定性的影响。

声明：本文所用图片、文字来源万方数据，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

相关链接：车前草，乙酸乙酯，乙醚，金黄色葡萄球菌