藜麦糠黄酮的抑菌性研究（一）

藜麦（Chenopodiumquinoawilld），原产于南美洲的玻利维亚、厄瓜多尔和秘鲁。在欧洲、非洲与亚洲普遍为实验性种植。藜麦中含量较高生物活性物质具有防癌、消炎、降血压、减脂等生理活性，如：芦丁、异槲皮素、槲皮素、山奈酚等，特别是藜麦类黄酮中的槲皮素与其苷类化合物的抗肿消炎、抗氧化的效果极为明显。近年来存在于植物中的天然黄酮类化合物多用于药品及保健品的开发。藜麦糠作为藜麦的副产品，其中纤维素、多糖、蛋白质含量丰富，并且含有大量皂苷、黄酮、多酚等生物活性成分。在实际生产加工藜麦及其相关产品时，藜麦糠一般多加工成牲畜饲料或直接当作废渣丢弃，利用率较低，造成大量的资源浪费。且国内外对藜麦的相关研究和文献多集中在其籽粒。对藜麦糠鲜有研究。藜麦糠具有一定的开发利用价值，应加以开发利用。

目前，常用的防腐剂有：山梨酸及其盐类、苯甲酸、对羟基苯甲酸酯，在食品工业使用时，其使用量及适用范围有严格限制与标准，过量使用会影响食品口感风味甚至危害人体健康。近年来，以生物体本身或其代谢产物为原料，经人工提取、酶法转化、发酵等技术产生的天然抑菌剂、抗氧化剂受到广泛研究与应用。

本文以藜麦糠为原料，利用超声辅助提取，经HPD950大孔树脂纯化得藜麦糠黄酮，以大肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、根霉作为受试菌种，通过平板计数法、抑菌圈法研究藜麦糠黄酮抑菌性。并探究样品pH、样液浓度、热处理对其抑菌性能的影响。以期提高对藜麦的综合开发与利用价值，为藜麦副产物的充分利用提供理论依据。

一、材料和方法

1、材料与仪器

藜麦糠：山西省华青藜麦产品开发有限公司提供；芦丁标准品：美国Sigma公司；HPD950大孔树脂：陕西蓝深特种树脂有限公司；其他所用试剂均为分析纯。大肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、根霉：山西大学微生物实验室提供。

HRHS24型电热恒温水浴锅：青岛海尔医用低温科技有限公司；JP-040ST型超声波清洗机：深圳市洁盟清洗设备有限公司；TG16A-WS型高速离心机：武汉爱斯佩科学仪器有限公司；

SP-2000UV型紫外可见分光光度：上海光谱仪器有限公司。立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯事业有限公司医疗设备厂；HRSP-H系列生化培养箱：青岛海尔特种电冰柜有限公司；PYX-DHS-50X65-S隔水式电热恒温培养箱：上海华邻有限公司，恒温培养摇床：青岛海尔特种电冰柜有限公司。

2、实验方法

（1）藜麦糠黄酮的提取与纯化

参考相关文献处理样品，藜麦糠经粉碎后过60目，通过索氏提取法去除样品中油脂等杂质（GB/T5009.6-2003）。然后精密称取一定质量样品粉末于干燥烧杯中，以料液比1：30加入乙醇溶液，浸泡10min后利用超声波清洗器辅助提取，结束后经过4000r/min离心20min后收集上清液进行真空抽滤，滤液经旋转蒸发浓缩，浓缩液备用。用HPD950树脂进行吸附，并用体积分数为75%的乙醇溶液洗脱，得到经纯化后的藜麦糠黄酮。

（2）菌种的活化及菌悬液的制备

菌种活化：在超净工作台上，用接种环在斜面培养基上挑取相应菌种，将细菌接种于Lb液体培养基在37℃恒温培养箱中培养24h，霉菌接种于PDA液体培养基中在30℃恒温培养箱中培养48h。菌悬液的制备：取活化好的细菌菌种于无菌水中摇匀制成菌悬液。梯度稀释，在相应的培养基上涂布，培养后平板计数得最佳稀释梯度。

（3）藜麦糠黄酮抑菌效果评价方法

本实验分别采用平板计数法与抑菌圈法评价样品的细菌、霉菌的抑制性能。

平板计数法：无菌条件下，吸取最佳梯度菌悬液100μL与1.2mg/mL的藜麦糠黄酮溶液100uL的样品均匀涂布于Lb固体培养基，以无菌水作为空白对照，培养24h后平板计数，按照下式计算抑菌率。

抑菌圈法：在无菌条件下，用移取100μL霉菌菌液均匀涂布至PDA培养基中，用灭菌后的不锈钢打孔器在平板上打出直径6.0mm的圆孔，每个平板均匀打出四个。移液管取100uL1.2mg/mLDE黄酮样品加至孔中，其中一个加入100μL无菌水作为空白对照，培养48h后利用标卡尺测量其直径，取平均值后并记录。

（4）抑菌性能影响因素考察

①浓度对藜麦糠黄酮抑菌效果的影响

将藜麦糠黄酮用无菌水稀释于灭菌的离心管中，得到质量浓度为0.15mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL的黄酮样液。以无菌水作为空白对照，利用大肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、根霉为供试菌种，按照无菌条件下，吸取最佳梯度菌悬液100μL与1.2mg/mL的藜麦糠黄酮溶液100uL的样品均匀涂布于Lb固体培养基，以无菌水作为空白对照，培养24h后平板计数，在无菌条件下，用移取100μL霉菌菌液均匀涂布至PDA培养基中，用灭菌后的不锈钢打孔器在平板上打出直径6.0mm的圆孔，每个平板均匀打出四个。移液管取100uL1.2mg/mLDE黄酮样品加至孔中，其中一个加入100μL无菌水作为空白对照，培养48h后利用标卡尺测量其直径，取平均值后并记录研究其抑菌效果。

②pH对藜麦糠黄酮抑菌效果的影响

将1.2mg/mL的藜麦糠黄酮用磷酸氢二钠-柠檬酸溶液、碳酸盐缓冲溶液调节其pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的黄酮样液。按照无菌条件下，吸取最佳梯度菌悬液100μL与1.2mg/mL的藜麦糠黄酮溶液100uL的样品均匀涂布于Lb固体培养基，以无菌水作为空白对照，培养24h后平板计数，在无菌条件下，用移取100μL霉菌菌液均匀涂布至PDA培养基中，用灭菌后的不锈钢打孔器在平板上打出直径6.0mm的圆孔，每个平板均匀打出四个。移液管取100uL1.2mg/mLDE黄酮样品加至孔中，其中一个加入100μL无菌水作为空白对照，培养48h后利用标卡尺测量其直径，取平均值后并记录研究其抑菌效果。

③热处理对藜麦糠黄酮抑菌效果的影响

将1.2mg/mL的藜麦糠黄酮置于四只离心管中，并分别在在30℃、50℃、70℃、100℃的温度下处理藜麦糠黄酮60min，考察不同温度处理对藜麦康黄酮抑菌效果的影响。

（5）最低抑菌浓度（MIC）的确定

用无菌水稀释得到质量浓度为：0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.15mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL、1.2mg/mL的藜麦糠黄酮溶液。先后取100uL最佳稀释梯度的菌液，100uL黄酮溶液均匀涂布在平板上，以无菌水做对照，细菌于37℃条件下培养24h，霉菌于30℃培养48h。将有菌生长的在最低藜麦糠黄酮浓度设为MIC。

3、数据处理

每组实验重复3次，记录数据，使用Excel处理并采用origin8.1软件对实验数据进行绘图。

二、结果与分析
1、菌悬液最佳稀释梯度的确定

按照在超净工作台上，用接种环在斜面培养基上挑取相应菌种，将细菌接种于Lb液体培养基在37℃恒温培养箱中培养24h，霉菌接种于PDA液体培养基中在30℃恒温培养箱中培养48h。菌悬液的制备：取活化好的细菌菌种于无菌水中摇匀制成菌悬液。梯度稀释，在相应的培养基上涂布，培养后平板计数得最佳稀释梯度方式梯度稀释。每稀释一次浓度降低10倍。经涂布后，平板计数，确定菌落数在30～300为最佳梯度。各个菌落结果如表1所示。

2、藜麦糠黄酮抑菌效果评价

由表2可知，藜麦糠黄酮对大肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌都有一定的抑菌性，但各受试菌种的敏感性不同。藜麦糠黄酮对枯草芽孢杆菌的抑菌的效果最为明显，其抑菌率达75.5%，且大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑菌率都在60%以上。但根霉的抑菌圈较小，仅有7.2mm，表明藜麦糠黄酮对细菌具有显著的抑制作用，对根霉的抑菌效果较差。

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