食品中微生物限量要求及检测技术发展趋势（二）

2食品微生物检验技术的现状

近几年，随着国际交流合作的开展、标准的进步以及我国科研水平的提高，相继出现了许多快速检测及鉴定技术和产品，食品微生物检测及鉴定技术也取得了较大的进展，主要体现在两大类方面，一类是在传统微生物培养法基础上进行改进，如以酶底物显色法为原理的显色培养基、测试片、全自动微生物检测鉴定仪等；另一类是基于抗体和核酸的快速检测技术以及围绕这两大类技术配套开发了自动化检测仪器，通过缩短检测时间、提高检测效率等方式进一步提高食品中微生物的检测准确性和效率[36，37]。

2.1微生物测试片法

测试片主要由培养基、冷水可凝胶、显色剂等组成。显色剂由微生物代谢物质、显色基团组成，微生物生长过程中的代谢产生的酶与显色底物发生反应而显色。与显色培养基原理一致。目前测试片的形式有以冷水凝胶为载体的，有以无纺布为载体的，有以滤纸为载体的几种形式。此方法检测项目包括：菌落总数、大肠菌群、霉菌酵母、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、环境李斯特菌等。测试片具有操作简单、判读清晰、降低误差、提高效率等优势，检测过程无需配置试剂，提高工作效率并有效降低实验误差，可以在24～48h内完成检测；结果判读以菌落显色为依据，相比传统培养基更容易计数，很适合实验室使用。目前市场上主要品牌有3M(美国)、美正生物(中国)、陆桥(中国)、DNP(日本)、环凯(中国)、检易(中国)。

2.2全自动快速培养及鉴定系统

随着自动化、高通量需求的提出，微生物检测技术逐步从传统人工操作向自动化的检测系统集合，包括仪器、试剂、分析软件等。全自动微生物检测系统目前市场上主要分为快速筛查、鉴定2个方向，也是基于传统微生物培养和鉴定的原理。

例如，纽勤的Soleris系统由实时光电检测仪、分析软件以及配套的检测试剂盒组成。Soleris检测系统的核心是即检即用的测试瓶，通过监控微生物生长代谢带来的pH值改变及其他生物学反应来进行检测和判断的。微生物的代谢产物使培养基的化学特性及试剂颜色发生改变，Soleris光学系统对上述化学变化产生的光度改变进行实时监控，微生物含量越高，检出时间越快。

法国生物梅里埃公司在酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)试剂盒的基础上研制了一种全自动免疫荧光酶标仪自动酶联荧光免疫测试，是集固相吸附、酶联免疫、荧光检测和乳胶凝集诸方法优点于一体的综合性检测系统，可用于检测食品及环境样本中的致病菌，其原理即是利用夹心ELISA方法，将抗体提前包被在固相接受器上，其他试剂固定在试剂条上，形成即用型试剂，插入仪器中，然后由机器分担所有工作，直至打印报告。一般经48h增菌过程后，多数检测可在50min内完成。

2.3免疫检测方法

免疫检测法的原理是基于抗原抗体的特异性反应对微生物进行快速检测的，主要分为胶体金检测卡和酶联免疫试剂盒2类。2种技术都已经非常成熟，国内主要用于农兽药残留、非法添加等检测，而微生物检测的产品相对较少。

胶体金检测卡应用“双抗体夹心法”的原理，目标致病菌和金标记的特异性单克隆抗体结合及预包被于NC膜T线位置的特异性多克隆抗体结合，金颗粒的聚集而显示明显的红线。通过肉眼直接观察是否出现T线，判断样品中是否含有目标菌。检测时，滴加增菌液10min左右即可进行结果判读，适合用于大量样本快速筛查。国内市场上主要有Romer、美正生物、默克等品牌，主要包括沙门氏菌、大肠杆菌O157、李斯特菌等检测项目。

ELISA试剂盒技术比较成熟，只要获得微生物特异性抗原抗体便可以开发快速检测ELSIA试剂盒，微生物检测一般采用夹心模式，因此具有较好的灵敏度和特异性[42]。国内市场主要包括拜发、梅里埃、美正生物等品牌。

2.4ATP荧光检测法

20世纪80年代，英国人首先研制出ATP检测仪，随后发展到欧洲、美国和日本。20世纪90年代，开始普遍应用于食品加工行业，应用范围涉及食品加工、超市和餐饮行业，ATP检测对象为微生物和食品残渣。

ATP存在于所有生物体中，通过检测ATP可以间接地证明生物体的存在。基于萤火虫发光原理，利用“荧光素酶—荧光素体系”快速检测三磷酸腺苷(ATP)，用于判断卫生状况。可用于食品加工过、餐饮、酒店、医院、养殖业等环境监控以及医疗系统和卫生监督机构即时采样监测。然而由于所有生命的生物体都可产生ATP，所以ATP法只能用来检测洁净度，通过实验测试估算微生物含量，而不能判定微生物是否存在或者含量。国内市场主要品牌有Hygiena、3M、Charm、西安天隆、Biocontrol、龟甲万等。

2.5PCR检测法

PCR技术已经广泛应用于医学领域、公安系统、农业、食品等领域，其中我国在GB4789微生物检验标准中，建立了致泻大肠埃希氏菌、诺如病毒、大肠杆菌O157、创伤弧菌、肉毒梭菌等检测PCR鉴定方法。根据核酸扩增和检测方式的不同，可以分为：荧光定量PCR技术、等温PCR技术、数字PCR技术、免疫PCR、核酸杂交技术、微流控芯片技术等，其中主要应用于食品检测的是荧光定量PCR技术和等温PCR技术，下面主要介绍这2种方法。

荧光定量PCR技术，是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，成为定量的依据。与传统PCR相比，荧光定量PCR产物无需电泳即可实时观察定量，反应快速，灵敏度高，目前已经在医疗诊断领域获得广泛应用，食品安全领域近些年刚起步，主要用于食源微生物、食品过敏源、转基因等项目的检测。目前国内PCR仪器主要品牌有赛默飞、罗氏、伯乐、天隆、雅睿、宏石等，应用于食品检测领域的试剂盒或检测系统主要品牌有杜邦BAX、默克、赛默飞、美正生物等品牌，试剂盒主要包括食品微生物常用的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、克罗诺杆菌属、大肠杆菌O157、单增李斯特菌、诺如病毒等核酸检测试剂盒。

等温PCR技术是近年新发展起来，扩增只需恒定温度(例如60℃)就能完成扩增，具有更高的灵敏度，且操作简单，该技术更适合于现场快速检测的应用。以3M的MDS分子检测系统为例，该系统采用环介导核酸等温扩增技术和生物荧光技术，通过捕获DNA扩增反应过程中产生的ATP而发出的生物荧光，实时自动化检测DNA扩增产物，以图表和直观检测点2种形式来表示检测结果。阳性结果可以在10～20min出现，阴性结果75min，操作简单，适合于实验室用来进行样本快速筛查。由于该方法一般对靶基因通常具有较低的检出限，这对实验室的布局要求、实验设备及人员操作提出了更高、更严格的要求，实验室务必执行分子生物学检验分区要求[48]，以避免阳性结果对实验环境的污染。

2.6质谱鉴定法

质谱是一种新型的微生物鉴定方法，可以快速对已知菌和未知菌进行鉴定，其原理是质谱仪离子源通过电离效应给予了待检测目标菌较高的能量，目标菌吸收能量后被激发，产生强烈的离子化效能，之后被载气带入质谱仪，通过电压的作用加速飞行，由于各个离子间具有不同的质荷比，会按照质量数的大小被分离，被捕获后的带电粒子在检测器上产的的信号信息也各不相同，通过与质谱库中标准图谱数据信息进行比对，来实现对细菌的鉴定。MALDI-TOF技术能够迅速有效的对于微生物的种类进行鉴定，但该技术也有一定局限性，一般依靠细菌图谱的参考对于细菌的种类进行鉴定，需要不断完善图谱数据库。目前国内市场上主要的品牌有布鲁克、安图、梅里埃等。

3结论与讨论

3.1《微生物检验方法确认和验证通则》的修订给非标方法验证提供依据

目前针对食品中微生物的快速检测方法和产品越来越多，给使用者造成了选择疑难问题，如何选择和评价一个适用于检测机构的方法或者产品成为使用者面临的主要问题。我国目前并没有针对快速检测方法和产品评价的流程和机构，国外AOAC、ISO等都有关于试剂盒验证评价的要求。基于微生物方法验证的需要，2019年立项修订《微生物检验方法确认和验证通则》，为非标方法验证提供验证流程和方法的依据。

3.2增菌环节是瓶颈，缩短增菌时间是重点研究方向

大部分食品中致病菌含量低，无需增菌步骤即能够检测食品中少量致病菌的方法很难实现，导致致病菌检测只能缩短检测时间而不能实现“快检”。在微生物的增菌环节，微生物的复苏能力、生长速度、选择性是评价一个增菌方法的条件；而特异性、检测时间及判读方式则是评价一个检测方法的必要条件。目前检测食源性致病菌都需要进行前增菌过程，但每种致病菌都有各自的生长习性和营养要求，不同的致病菌需要用不同的增菌培养基，这在很大程度上限制在实际检测中的应用，开发一种广谱快速增菌培养基是未来技术的重点方向之一。

3.3过程控制逐渐受到重视，方法体系需要多考虑企业实际应用

基于风险分析的从农田到餐桌全过程管理是国际通用的管理理念和制标原则，我国食品安全管理方式正逐渐从“以终产品检验合格为目的”向“以过程控制为重点”的方向转变，我国的标准体系向强化基础标准和过程标准(食品生产规范、Haccp体系)的方向转变。过程控制应用环节，企业可以建立适合的检测方法体系，使用快速检测方法，使快速检测方法得到发展。

食品企业微生物检测有几个共性的特点：样本种类多，样本量大，实验室条件方面较差，检测人员技术水平参差不齐，流动性较大。整个食品微生物检验过程中，都需检验人员具有良好的分析能力与判断能力，对于一些新兴的检测技术接受起来相对困难。所以，企业在选择微生物检测技术上会考虑这几点，操作方便性、可培训性、实验室条件是否满足准确性、成本等因素。

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