多种不同方法对微生物能力验证样品测试结果的比较及分析（一）

目的在检测实验室能力验证样品时，通过多种方法进行比较，提高检测能力和结果准确性。方法菌落总数依据国标方法，在相同条件下由不同操作人员重复测定共10次，通过测量结果的不确定度的评定确定置信区间。大肠菌群通过3种方法计数，用大肠杆菌/大肠菌群测试片对大肠埃希氏菌进行快速定性判定。金黄色葡萄球菌通过不同培养基、涂布量、接种方法的7种不同组合方法进行检测。结果本次能力验证结果报告菌落总数结果为23000CFU/mL、大肠菌群结果为10000CFU/mL、金黄色葡萄球菌结果为12000CFU/mL、大肠埃希氏菌检出。4项测试结果均为满意。结论通过多种方法同步进行，能有效提高检测能力和结果准确性。

引言

菌落总数和大肠菌群都是指示菌，用来判定食品被污染程度及卫生质量，在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。金黄色葡萄球菌是化脓性炎症感染中主要的食源性致病微生物。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国，由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。近年来研究表明金黄色葡萄球菌的耐药率呈上升趋势。金黄色葡萄球菌引起的葡萄球菌性乳腺炎为乳品行业造成严重经济损失，且经过30年的研究仍没有一种有效的疫苗投入市场。

能力验证是一种重要的利用实验室间比对的质控手段，定期参加能力验证，能有效提高实验室技术操作能力和分析鉴定能力，找出差距并加以改进，从而提高实验室检测能力。为提高食品微生物检测能力，增强实验室竞争力，本实验室报名参加了ACAS-PT890(2020)中日联合微生物检测技能考核(2020年第1回合)能力验证。复原后等同于60mL的食品样品，共进行菌落总数、金黄色葡萄球菌(定量)、大肠菌群(定量)、大肠埃希氏菌(定性)4个项目的检测。本研究通过比较不同的检测方法以及数据分析过程，为实验室参加能力验证提供参考依据，具有重要的现实意义。

1材料与方法

1.1样品

ACAS-PT890(2020)中日联合微生物检测技能考核第一回合，样品为冻干粉，编号为20-H822，来自中国检验检疫科学研究院测试评价中心。

1.2培养基及试剂

平板计数琼脂(platecountagar，PCA)、结晶紫中性红胆盐琼脂(violetredbileagar，VRBA)、煌绿乳糖胆盐肉汤(brilliantgreenlactosebilebroth，BGLB)、Baird-Parker琼脂(Baird-Parkeragar)、伊红美蓝琼脂(eosin-methyleneblueagar，EMB)、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(laurysulfatetryptosebroth，LST)、EC肉汤(E.colibroth)、脑心浸出液肉汤(brainheartinfusionbroth，BHI)、大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒IMViC生化实验[I：吲哚(indol)实验，M：甲基红(methylred)实验，V：乙二酰(PVoges-Proskauer)实验，C：枸橼酸盐利用(citrateutilization)实验]、金黄色葡萄球菌测试片、大肠杆菌/大肠菌群测试片(北京陆桥技术股份有限公司)；金黄色葡萄球菌显色培养基(法国科玛嘉微生物技术有限公司)；0.85%无菌生理盐水(实验室自制)。

1.3实验仪器

HR40-IIA2生物安全柜(洁净等级：100级，青岛海尔股份有限公司)；SPX-250BSH-II生化培养箱(控温范围：0～60℃，上海新苗医疗器械制造有限公司)；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器(灭菌温度设定范围：50～126℃，上海申安医疗器械厂)；HBM-400B样品匀质机(可变速度：6～9次/s，天津市恒奥科技发展有限公司)。

1.4实验方法

1.4.1样品处理

收到样品后立即保存于2～8℃冰箱，实验前从冰箱中取出，到达室温后再开启。无菌操作，开启后立即进行再水化，样品共有60mL生理盐水再水化。具体步骤：样品开启后，立即加入20mL生理盐水，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，再用余下的生理盐水清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述无菌瓶中，此溶液即是待测样品原液。再取25mL样品原液于225mL生理盐水中制成1：10样品匀液，进行检验。

1.4.2方法

(1)菌落总数

取1mL1：10样品匀液加入到9mL生理盐水中，振摇试管制成1：100的样品匀液，按上述操作程序制备10倍系列稀释样品匀液。选择10‒1、10‒2、10‒3、10‒44个稀释度，计数按照GB4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行。

(2)大肠菌群

10倍系列稀释样品匀液，选择10‒1、10‒2、10‒3、10‒44个稀释度分别按照GB4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》[8]第一法[大肠菌群最可能数(Mostprobablenumber，MPN)计数法]、第二法(大肠菌群平板计数法)进行计数和确认。同时用大肠杆菌/大肠菌群测试片法进行计数，每片接种量为1mL，(36±1)℃培养24h。大肠杆菌为靛蓝或蓝紫色菌落，其他大肠菌群为蓝绿色菌落。

(3)金黄色葡萄球菌

10倍系列稀释，选择10‒1、10‒2、10‒3、10‒44个稀释度采用不同培养基、涂布量、接种方法(涂布或混匀倾注)的7个组合进行检测。典型菌落按照GB4789.10—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》第一法通过镜检、血浆凝固酶实验进行确认，计算阳性比例。7种方法比较结果见表1。

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