多种不同方法对微生物能力验证样品测试结果的比较及分析（二）

2结果与分析

2.1菌落总数检测结果与分析

能力验证样品具有很高的均匀性和稳定性，不确定度主要来源于重复性测定引入的A类不确定度。在相同条件下由不同操作人员重复测定共10次，检验结果取对数后计算不确定度，检验结果及中间计算过程见表2。

扩展不确定度U=kuc(lgX)。

取置信水平为95%，包含因子k=2，扩展不确定度U即为0.008420×2=0.01684。

本次能力验证菌落总数结果对数值的平均值为4.363(lg)，取值区间为4.363±0.01684(lg)，即为4.3462～4.380(lg)，取其反对数菌落总数为22190～23979CFU/mL。故本次能力验证菌落总数报告范围为2.2×104～2.4×104CFU/mL。

2.2大肠菌群检测结果与分析

本实验室同时报名了大肠菌群定量检测和大肠埃希氏菌的定性检测。大肠杆菌/大肠菌群测试片能测定大肠菌群的数量又能明显地区分大肠埃希氏菌和其他大肠菌群，故本实验室同时使用大肠杆菌/大肠菌群测试片法进行检测。对VRBA平板上的典型和可疑菌落进行验证，得到阳性比例为100%。检测结果见表3。

由表3可以看出3种检测方法虽然培养基与方法不同，所得检测数值比较接近。且大肠菌群VRBA平板计数法和大肠杆菌/大肠菌群测试片法结果在大肠菌群MPN计数法95%可信限范围内。

同时从LST阳性管中转接到EC肉汤管中进行复发酵实验，按照GB4789.38—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数》第一法进行EMB平板划线和IMViC生化实验进行确证。结果显示大肠埃希氏菌检出，这与大肠杆菌/大肠菌群测试片法结果一致，与国标方法相比更快速直观。

2.3金黄色葡萄球菌检测结果与分析

按照7种检测方法分别进行检测，每个方法分别由4名检测员进行操作，结果取4个检测结果平均值。本实验挑取可疑菌落进行确证，得阳性比例为100%。检测结果见表4。

由表4可以看出Baird-Parker平板涂布法和倾注法结果均高于金黄色葡萄球菌显色平板和金黄色葡萄球菌测试片，Baird-Parker琼脂中添加卵黄，营养较为丰富。而金黄色葡萄球菌显色培养基和金黄色葡萄球菌测试片中未含有卵黄且含有抑制其他菌生长的物质，故检出率较小。

比较2种不同接种量的定量比对结果，接种量为0.3、0.3、0.4mL在Baird-Parker平板和金黄色显色平板结果分别为12000CFU/mL、8800CFU/mL，接种量为0.2、0.2、0.2、0.2、0.2mL在Baird-Parker平板和金黄色显色平板结果分别为13000CFU/mL、10000CFU/mL。接种量0.3、0.3、0.4mL结果低于接种量为0.2、0.2、0.2、0.2、0.2mL。可见减小每皿的涂布量，减小菌落重叠，增大检出率。

倾注法相比于涂布法无明显差异，金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧。倾注法操作相对简单，免去了Baird-Parker平板表面水分干燥和涂布等步骤，在做能力验证样品时作为比对方法，可有效提高结果的准确性。

纸片法结果为8600CFU/mL低于其他方法，由于采用的培养基成分不同、纸片面积和操作方法不同造成结果有差异。纸片法是取1mL加入到纸片上，且纸片面积较平板小很多，容易造成重叠。检验过程需采用多个稀释度防止漏检，确保在可计数范围内。

由表4可见7种方法结果无明显差异，考虑到本次为能力验证样品，所以金黄色葡萄球菌报告结果为国标法即Baird-Parker平板计数法加样量为0.3、0.3、0.4mL，即为12000CFU/mL。

2.4能力验证结果

该次能力验证有97个实验室参加，其中菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌检测满意率分别为92.0%、90.5%、95.1%、96.3%，本实验室4个项目均取得满意结果。本次能力验证结果及评价见表5。

3讨论

参加能力验证时收到样品后应立即冷藏保存，如果冷冻保存，将导致菌数降低；样品检验时，等待样品达到室温再进行水化，否则因为温度迅速升高导致细胞破裂，影响目标菌检验结果；充分水化，水化过程是影响最后结果的关键步骤，水化不彻底或不均匀会直接影响实验结果；多次加水反复清洗后进行充分振荡，避免样品不均匀或细胞没有充分分散；水化后立即进行检验，放置时间过长会导致菌体死亡，造成结果偏低；同时还需加强人员培训，提高人员素质及加样准确度；加强质控，尤其是培养基和试剂的质控。

本次能力验证菌落总数采用PCA直接倾注法，为了防止添加一些快速生长导致菌落蔓延的需氧菌，待琼脂凝固后再在上面覆盖一层约5mL左右的琼脂，提高检测结果的准确性。实验中也可通过添加2，3，5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazoliumchloride，TTC)使菌落显现红色，易于识别计数，同时可部分抑制菌落蔓延。也可用陶瓦盖代替平皿盖去除培养基表面水分，防止细菌移动蔓延。

大肠菌群结果偏高，分析可能是实验中添加了一些杂菌，在VRBA平板上菌落形态与大肠菌群相似为紫红色菌落，且在做确证实验时未被挑取，导致阳性率偏高，结果偏高。可通过增加挑取可疑菌数，增强结果准确性。而快速检测纸片法，利用预配置的基质琼脂于纸片或胶片上，省去了配制培养基和灭菌过程，抗干扰能力强，具有较高的灵敏性、特异性和选择性，利用不同的显色酶使不同类型微生物显现不同的状态，可以快速判断微生物类型，结果更接近于中值。

用于金黄色葡萄球菌计数的Baird-Parker平板提前放在25～50℃的培养箱中干燥，直到表面水珠消失。涂布时要充分用L涂布棒涂匀，不要触及平板边缘，由于表面张力大不利于细菌在边缘缝隙生长，影响观察计数。涂布后正置培养1h再倒置。进行确证实验时BHI培养不超过24h，防止菌龄老化造成凝固酶活性降低出现假阴性，同时做阳性对照阴性对照和空白对照。

在能力验证中采用多种方法同步进行能力验证样品检测，可以使实验室更有把握地报出结果，提高了测试结果的准确性。本次验证中为一个样品共60mL同时检测4个项目，且含有不同种类的干扰杂菌，增加了一定难度。通过参加中日联合微生物检测技能考核能力验证活动，提高检测人员检测技能，确保实验室检验质量，是本实验室检验能力的最好证明。

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